[发明专利]一种紫花肾茶的分子鉴定方法

权利要求书

1.一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于按以下步骤进行：

1)取样及样品处理：采用正常生长肾茶，分别将紫花肾茶和白花肾茶的新鲜幼叶放入冰盒，置于-80℃超低温冰箱中储存24h，在低温条件下研磨成粉末状；

2)DNA提取及其纯度和浓度检测：取0.2g幼叶干粉，采用CTAB法提取总DNA，使用1.0％质量浓度琼脂糖凝胶电泳对所得基因组DNA的纯度进行检测，利用蛋白核酸定量测定仪检测DNA浓度；

3)引物筛选和PCR扩增：在对紫花肾茶进行SRAP分析的PCR扩增体系优化后，选取紫花肾茶和白花肾茶进行SRAP引物筛选，筛选出引物组合CS1和CS2，在PCR仪上进行DNA扩增，所述CS1引物为：正向引物序列为：TGAGTCCAAACCGGATA，如SEQ ID NO.1所示；反向引物序列为：GACTGCGTACGAATTTGA，如SEQ ID NO.2所示；所述CS2引物为：正向引物序列：TGAGTCCAAACCGGAAT，如SEQ ID NO.3所示；反向引物序列：GACTGCGTACGAATTTGC，如SEQ IDNO.4所示；

4)PCR扩增产物检测：扩增产物用测序仪进行毛细管电泳，电泳时间60min，电压为15000V，用GeneMapper 3.2软件分析获得电泳图谱文件；

5)电泳图谱比较：将待鉴定的肾茶按照步骤1)-4)的操作顺序及方法进行分析，得到待鉴定的肾茶SRAP电泳图谱，将此SRAP图谱与步骤4)获得的电泳图谱文件进行比较判定，判断其是否为紫花肾茶。

2.根据权利要求1所述的一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于：采用CTAB法提取总DNA的具体过程包括：

(1)取6mL预热到65℃的2×CTAB溶液于装有叶片粉末的离心管中，65℃水浴20分钟，期间取出混合3至5次，使粉末和溶液充分混匀；

(2)取出离心管，待冷却至室温后，加入6mL氯仿-异戊醇，且氯仿与异戊醇的体积比为24：1，置于摇床上充分混匀5分钟；

(3)室温12000rpm离心10分钟；

(4)将上清液转入新的离心管中，加入2倍体积-20℃预冷无水乙醇，混匀，在-20℃冰箱中静置5分钟；

(5)室温12000rpm离心10分钟；

(6)弃上清液，DNA沉淀风干后，溶解于800μL去离子水中，作为PCR的模板DNA，-20℃保存备用。

3.根据权利要求1或2所述的一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于：所述的DNA浓度大于10mg/mL，OD_260/280的比值在1.8-2.0之间，OD_260/230的比值在2.0-2.5之间。

4.根据权利要求1所述的一种紫花肾茶的分子鉴定方法，其特征在于：所述的PCR扩增的反应程序为：首先94℃预变性5min；其次94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；然后94℃变性1min，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃后延伸10min。