[发明专利]基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法

权利要求书

1.一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法包括如下步骤：

S1：获得产甲烷厌氧菌的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(M.Barkeri PylRS)突变库；

S2：获得7-羟基香豆素赖氨酸；

S3：筛选特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶突变体(CouKRS)，所述步骤S3包括：步骤S31，构建和转化用于正筛选作用的pylT-pREP质粒；步骤S32，构建用于表达验证的pylT-pBAD质粒，进行转化和筛选，获得能够特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的CouKRS的菌株，所述pylT基因编码7-羟基香豆素氨酰-tRNA合成酶；

S4：在鲸鱼肌红蛋白的4种密码子标签(Myoglobin-4TAG)中插入7-羟基香豆素赖氨酸，验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质特定位点插入；

所述步骤S1包括如下步骤：

S11：人工合成M.Barkeri PylRS的DNA序列；

S12：将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，获得重组质粒A；

S13：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK，所述引物f-Y349D的序列为atggtggatggcgataccctggatattatgcatg，所述引物r-Y349D的序列为tcgccatccaccatgcagctatcgcccaca，所述引物f-L270I的序列为gaccatctataactatctgcgtaaactggatc，所述引物r-L270I的序列为gccgatcaccatgcagctatcgcccacaatttc，所述引物f-N311F313NNK的序列为catggttNNTtttNNTcaaatgggcagcggctgcacccgtgaaaac，所述引物r-N311F313NNK的序列为catttgANNaaaANNaaccatggtgaattcttccaggtgttctttg，所述引物f-Y349NNK的序列为atggtgNNKggcgataccctggatattatgcatg，所述引物r-Y349NNK的序列为tcgccMNNcaccatgcagctatcgcccacaat；

S14：以所述重组质粒A为模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库1；

S15：以所述突变库1为模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库2；

S16：以所述突变库2为模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库3；

S17：以所述突变库3为模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK为引物，通过聚合酶链式反应，获得突变库4；

S18：将所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4混合，获得用于7-羟基香豆素赖氨酸筛选用的M.Barkeri PylRS突变库。

2.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述突变库1、突变库2、突变库3和突变库4按照1:1:32:32的比例进行混合。

3.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述步骤S2包括如下步骤：

S21：取间苯二酚，溶于水中，并加热到90℃，滴加苹果酸，反应2小时后即可得到7-羟基香豆素A；

S22：取上述7-羟基香豆素A和赖氨酸于60℃搅拌，经过12小时；经液相色谱分离，滤膜过滤除菌，得到7-羟基香豆素赖氨酸，所述7-羟基香豆素赖氨酸经过0.22微米滤膜过滤除菌。

4.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述CouKRS的突变位点为L270I,Y349D,N311A,N313G。

5.如权利要求1所述的基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，其特征在于，所述步骤S4包括如下步骤：

S41：共转化CouKRS-pBK和Myoglobin-4tag-pBAD至TOP10中；

S42：获得纯化的Myoglobin蛋白质；

S43：将上述S42中获得Myoglobin蛋白质在488nm激光激发下，发出荧光，即可验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质特定位点插入。