[发明专利]基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法

说明书

本发明公开了一种基于7‑羟基香豆素的定点荧光标记方法，通过合成M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并将所述DNA序列连接到pBK质粒上；通过采用“饱和突变”的方法，构建了能够在原核和真核生物细胞中表达的M.Barkeri物种的吡咯赖氨酸氨酰‑tRNA合成酶突变库Lib‑CouKRS；通过合成用于定点荧光标记的7‑羟基香豆素赖氨酸，进行筛选和验证。本发明基于7‑羟基香豆素的定点荧光标记方法达到了基于7‑羟基香豆素在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法。

背景技术

蛋白质荧光标记是一种用于研究蛋白质结构和功能的重要手段。目前已有的荧光标记技术大致包括以下几种：(1)基于荧光蛋白(如绿色荧光蛋白Green FluorescentProtein GFP)融合表达进行蛋白质标记方法；(2)基于催化荧光基团(如罗丹明，FITC等)和蛋白质的特定氨基酸残基(如半胱氨酸Cys或赖氨酸Lys)间形成共价键，实现蛋白质的荧光标记；(3)基于化学或光“点击反应”，实现蛋白质定点荧光标记；(4)基于基因编码的香豆素酪氨酸方法实现蛋白质的定点荧光标记。受技术条件所限，这几种技术方法都有一定的缺陷：(1)荧光蛋白质(如绿色荧光蛋白质GFP)只能通过融合表达的方法标记在蛋白质的氮(N)端或碳(C)端，无法在蛋白质氨基酸其他序列中实现标记；且由于GFP体积较大，会对蛋白质结构和功能造成影响，其应用范围有限。(2)通过荧光基团和蛋白质氨基酸残基进行化学反应实现蛋白质荧光标记的方法，无法做到单一位点特异性，对于研究蛋白质相互作用具有一定的局限性。(3)基于“点击反应”的方法，需要化学或光照催化，会影响蛋白质的活性。(4)基因编码香豆素酪氨酸的方法，可以做到定点荧光标记，由于香豆素酪氨酸具有较强的量子产率，此方法可用于多种蛋白质的荧光标记，然而目前尚无法在真核生物里实现香豆素酪氨酸的定点插入。而吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶可以在细菌和真核细胞中实现穿梭，筛选特异识别7-羟基香豆素赖氨酸的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶，可解决上述问题。

基于此，本发明基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法能够在真核生物(哺乳动物细胞)中实现目的蛋白质的氨基酸序列的任意位点的荧光标记，旨在解决目前荧光标记方法无法实现真核生物蛋白质定点荧光标记制备问题。

为实现上述目的，本发明提供一种基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法，所述基于7-羟基香豆素的定点荧光标记方法包括如下步骤：

S1：获得M.Barkeri PylRS突变库；

S2：获得香豆素赖氨酸；

S3：筛选特异识别7-羟基香豆素的吡咯赖氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突变体；

S4：在鲸鱼肌红蛋白Myoglobin-4TAG中插入7-羟基香豆素赖氨酸，验证筛选得到的CouKRS能够实现在目的蛋白质制定位点插入。

优选地，所述步骤S1包括如下步骤：

S11：人工合成M.Barkeri PylRS的DNA序列；

S12：将上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA连接到pBK质粒上，获得重组质粒A；

S13：设计定点突变引物，所述定点突变引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引物f-L270I、引物r-L270I、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK；