[发明专利]仿刺参的雌核发育诱导方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种仿刺参的雌核发育诱导方法。

背景技术

人工诱导雌核发育有利于快速建立纯系，因此对于遗传育种及基础生物学的研究具有重要意义。在海产经济贝类方面，该领域的研究相对滞后，目前仅在近十种海洋经济贝类中进行了人工诱导雌核发育的研究。这些研究主要是通过使用各种辐射或化学方法灭活精子，从而诱导卵子的雌核发育。研究中常用的同源精子灭活法难以排除外源精子基因组的干扰，所以近年来有学者尝试采用异源精子诱导来消除这种干扰，如在栉孔扇贝和盘鲍等贝类中的研究。然而，异源精子诱导依赖于物种的特异性，且受多种环境因素的影响，如精卵的不同成熟度等，另外卵子的激动也往往不同步，而且如果灭活不充分的话，其实仍有精子污染的问题，因此限制了其在雌核发育中的应用。

与传统的同源或异源精子诱导法相比，电刺激诱导法在整个过程中不需要精子的参与，能彻底排除外源精子基因组的干扰，是理想的诱导方法。该方法已在兔、猪、鼠和牛等哺乳动物中被广泛应用并取得了很大的成功。其机制是采用电刺激的方式，使卵母细胞膜上形成可逆微孔，缓冲液中的钙离子顺细胞内外的浓度梯度而进入卵胞质，引发钙库释放钙离子或者胞质钙离子的迅速转移，从而模拟正常受精时钙离子规律性的波动现象启动卵子发育。但迄今为止，该方法在海洋生物雌核发育研究中，尚无报道。本研究首次尝试采用电刺激法诱导仿刺参雌核发育，对其诱导参数及雌核发育过程中的细胞学机制进行初步探索，旨在建立电刺激诱导仿刺参雌核发育的技术方法。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在建立电刺激诱导仿刺参雌核发育的技术方法。

一种仿刺参的雌核发育诱导方法，采用电刺激法，电刺激前先将卵子移入电刺激缓冲液中平衡 2min,调好电脉冲仪参数，用吸管吸取 1ml 卵子放入电击杯中，即可进行电刺激处理；

所述电刺激缓冲液为Zimmerman氏缓冲液，具体成分为：0.1 mmol/L Ca(C₂H₃O₂)₂H₂O，1 mmol/L K₂HPO₄，0.5 mmol/L Mg(C₂H₃O₂)₂·4H₂O，0.1 mmol/L 还原型谷胱甘肽，1% BSA，0.28 mmol/L蔗糖；

所述电脉冲仪参数为场强0.8 kv/cm，电容3 µF，2次电脉冲。

所述电刺激时的卵子密度为11×10⁴个/ml。

电刺激后卵子及胚胎的培养方法为：经电刺激后的卵子被放入直径 15 cm 培养皿中，用高温蒸煮的过滤海水培养，水温保持 20℃，培养密度为每个培养皿中每升约 2×10⁵个卵子；培养初期每半小时轻轻搅动海水一次，以后每 3~4h 搅动一次，以促进其孵化。

电刺激处理后 2 小时统计各组的卵裂率，24 小时统计胚胎存活率；

卵裂率或雌核发育诱导率=发生卵裂和排放极体的卵数/观察总卵数×100%；

胚胎存活率=上浮的原肠胚数量/发生卵裂的总卵数×100%。

本发明的方法简单有效，经电刺激诱导后，仿刺参的卵裂率可达到28%以上，胚胎存活率可达到98%以上。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

亲本的暂养与精卵的收集

仿刺参取回后暂养于14℃循环海水中，雌雄个体分开暂养。投喂饵料。暂养期间每天升温1℃，至16~17℃恒温待产。采用光照刺激法获得卵子，待卵子产出后，先用 300 目筛绢过滤卵子，然后用 500 目的筛绢过滤收集卵子，稀释后显微镜下观察定量卵子的密度。根据实验需要调整卵子的密度。

仿刺参卵子的电刺激处理

卵子雌核发育的诱导：采用电刺激法，电刺激前先将卵子移入电刺激缓冲液中平衡 2min,调好电脉冲仪参数，用吸管吸取 1ml 卵子放入电击杯中，即可进行电刺激处理。