[发明专利]一种魔芋基因组含量值的快速测定方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种魔芋基因组含量值的快速测定方法。

背景技术

魔芋（Amorphophallus）属天南星科（Areaceae）魔芋属多年生草本植物，主要栽培种为花魔芋（Amorphophalluskonjac）、白魔芋（Amorphophallusalbus）、田阳魔芋（AmorphophalluscorrugatusN.E.Brown）、西盟魔芋（AmorphophalluskrauseiEngler）、攸乐魔芋（AmorphophallusyuloensisH.Li）和勐海魔芋（AmorphophalluskachinensisEngl.EtGenrm）六种，广泛分布于湖北、云南、四川等长江流域。魔芋的变态茎宿存于地下，通常呈球形、扁球形或柱状球形，营养十分丰富，含淀粉35%，蛋白质3%，以及多种维生素和钾、磷、硒等矿物质元素，还含有人类所需要的魔芋多糖，即葡萄甘露聚糖达45%以上，并具有低热量、低脂肪和高纤维素的特点。魔芋因其块茎内富含葡甘聚糖（Konjacglucomannan）、各种人体必需氨基酸和微量元素而广泛用于食品、医药、保健、农业、化工、纺织、石油钻探等领域，具有极大的商业价值、食品价值与药用价值。

目前关于魔芋的细胞学研究主要集中在染色体计数及核型分析上，国内外报道魔芋的染色体数目为2n=24、26、28、32等，其中大部分为2n=26。近来韦松基和温标才报道了桂平魔芋（AmorphophalluscoaetaneusS.Y.LiuetS.J.Wei）染色体的数目及核型分析结果：染色体数目2n=26，核型公式为2n=2x=26=20m+6sm，属“2B”型，将其与魔芋属其他种类的核型比较，说明桂平魔芋为较原始的物种。目前对于魔芋染色体带型的研究仅限于利用Giemsa带型来探讨部分魔芋种的进化。而因魔芋种类较多，基因组较大，且细胞多含多聚糖而粘性过大导致其细胞学实验的难度性，对于魔芋的基因组含量值大小，一直鲜少有报道。基因组含量值作为物种基础数据，其大量、快速、准确的确定有利于魔芋后续基因组学方向的研究。

流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是20世纪70年代发展起来的一种高精度检测技术，起初主要用于医学和动物学，包括细胞凋亡、肿瘤学、免疫学和血液学等的研究。20世纪80年代，Galbraith等首次将流式细胞术用于植物细胞周期检测和细胞核DNA含量测定，开辟了流式细胞术应用于植物研究的先河。由于该技术在植物研究中具有多功能、高精度、大通量等特点，目前已在多种植物体上得到实现。流式细胞术作为一种快速测定基因组含量值的方法具有高效、准确等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种魔芋基因组值的快速测定方法，该方法操作简便、易行，对于基因组含量值的测量准确可信，适用于多品种大数量的魔芋的基因组含量值测定、比较分析。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种魔芋细胞核提取液，每1.5mL的配制如下：取5.55mgKCL，3.69mgMgSO₄，1.8mg4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes），36.3μL10%TritonX-100，0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），用蒸馏水溶解至1.5mL。

所述的魔芋细胞核提取液在基因组含量测定中的应用。

一种魔芋基因组含量值的快速测定方法，包括如下步骤：

（1）取魔芋幼嫩叶片，玉米白化幼嫩叶片为内参。

（2）将魔芋、玉米的幼嫩叶片混合剪碎后加到上述魔芋细胞核提取液中，用刀片垂直切碎后过滤除去悬浮物。

（3）过滤后的细胞悬液离心后弃上清液。

（4）离心后的沉淀用MgSO₄缓冲液重悬。每445μLMgSO₄缓冲液的配制为：取5.55mgKCL，3.69mgMgSO₄，1.8mgHepes，用蒸馏水溶解至445μL。

（5）往细胞重悬液中加入核糖核酸酶（RNAse）和碘化丙啶（PI）染料，混匀后避光染色。

（6）染色后的细胞悬液于流式细胞仪下测定。

优选的，所述的魔芋基因组含量值的快速测定方法，包括如下步骤：

（1）取魔芋幼嫩叶片约0.5g，玉米白化幼嫩叶片0.2g作为内参。