[发明专利]登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明适用于病毒检测试剂盒技术领域，提供了一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT‑PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型引物和基因探针，该检测方法使用登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT‑PCR一步MIX检测试剂盒进行检测。本发明登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT‑PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法与现有技术比较，能够一步同时实现登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型的检测，且具有灵敏度高、特异性强、周期短、准确度高等优点。

技术领域

本发明属于病毒检测试剂盒技术领域，尤其涉及一种登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR一步MIX检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。

登革热病毒是小型黄病毒，属于黄热病毒属，能引起登革热急性传染病，通常由在白天叮咬人的埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，登革热病毒感染人类不仅可引起登革热(Denguefever，DF)，还可引起登革出血热(Dengue hemorrhagic fever。DHF)和登草休克综合症(Dengue shock syndrome，DSS)，可导致30-40％的患者死亡。登革病毒在血清学上根据E蛋白抗原性不同分为I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型。初次感染产生的型特异性抗体不仅对其他型别的登革病毒没有交叉免疫保护作用，甚至在异型病毒二次感染时还可能增强病毒的感染，导致更为严重的DHF/DSS。世界各国曾多次造成大规模暴发性登革热病毒疫情；仅2014年相关统计，马来西亚登革热病例已累计超六万例；斯里兰卡今年共确诊近三万例；巴西今年共确诊七万多例，中国广东省三万多例。

目前，确诊登革热病毒感染的实验室检测方法通常包括分离登革病毒、检测病毒的核酸、抗原或抗体或几种检测方法的联合使用。具体的，

1.病毒分离：经细胞培养分离病毒，需要生物安全二级(BSL-2)实验室及必要的仪器设备，在标本运输过程中保持低温(冷冻或冷藏)对于病毒分离非常重要。将标本接种于蚊源细胞(C6/36)或哺乳动物细胞(BHK21、Vero)进行分离培养，出现病变以后，用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒。分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长，需要数天，不适于快速诊断。

2.核酸检测：多种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法可用于登革病毒核酸检测，包括一步法RT-PCR、实时荧光RT-PCR或套式RT-PCR等方法等。核酸检测可在1-2天内鉴别病毒RNA。在病人标本中检出病毒核酸，可确诊且能分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份标本(发病5天后)开展血清学检测，进行确诊。

3.抗原检测：NS1抗原检测可采用ELISA方法或快速检测试剂，可在几十分钟到数小时完成检测，适于现场使用，是登革热急性期诊断的重要手段，在发病后1天即可检出，也有报道在发病后18天仍可在血标本中检出。目前该方法尚不能分型。由于NS1抗原检测方法的特异性，也可用于黄病毒感染的鉴别诊断。基于我国登革热流行的特点，国家卫生计生委颁发的《登革热诊疗指南(2014年第2版)》将标本中检出NS1抗原作为确诊病毒感染依据，可用于早期诊断。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份标本(发病5天后)开展血清学检测，进行确诊。