[发明专利]一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用。

背景技术

纤维素酶来源广泛、成分复杂，广泛存在于昆虫体、软体动物体以及真菌、细菌与放线菌等微生物的代谢产物中，主要生产途径是微生物发酵，其中以丝状真菌和细菌纤维素酶应用最为广泛，目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶。

在细菌中大多数好氧细菌和厌氧细菌都富含丰富的纤维素酶系，特别是瘤胃中富含多种纤维素降解酶系的厌氧菌。世界纤维素市场中的纤维素酶有20％来自木霉属和曲霉属。主要是由于丝状真菌具有产酶的诸多优点：①产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；②产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；③同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。纤维素酶是一个复合酶系，酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶(EG，Cx酶，又称CMC酶)、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH，C1酶)和β-葡萄糖苷酶(BGL，纤维二糖酶)；大多数编码纤维素酶的基因是染色体基因。纤维素酶系降解原理目前尚无定论，主要有三种作用机理：协同理论、碎片假说和原初反应假说，其中以协同理论被大部分研究学者和专家所认可，其主要观点为内切葡聚糖这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量非还原性末端。然后外切葡聚糖酶逐个切下纤维素的非还原末端水解产生纤维二糖；而β-葡萄糖苷酶则水解纤维二糖生成葡萄糖。三者缺一不可，协同作用，也只有在合适的比例和组成下，才能共同作用快速实现纤维素的完全水解。

我国对纤维素酶的研究和生产也已开展了广泛的研究，但大多采用固体发酵方式，固体发酵虽有许多优越之处，但仍有发酵水平不稳定，不适于大规模生产等弊端，因此对纤维素酶液体深层发酵的研究很有意义。纤维素酶发酵过程容易受到碳水化合物阻遏效应(CCR)对酶发酵合成的影响，即在半纤维素和/或纤维素酶合成过程中，往往由于培养基中存在着葡萄糖、木糖等单糖而通过碳水化合物阻遏效应(CCR)抑制了酶的合成。专利CN200910091968提供了一种高产纤维素酶的方法，通过补料和溶氧对控制发酵过程菌体浓度来实现纤维素酶发酵酶活力的提高发酵，其补料为非常复杂的成分，包括价格昂贵的槐糖、乳糖等及多种微量元素，同时其培养基成本较为昂贵。如何既能解决液体深层发酵后期营养的快速需求和固体基质降解速率慢的问题，又能解决补加葡萄糖容易造成碳水化合物阻遏的问题，属于本领域技术人员面临的难题。

此外，纤维素酶产生真菌产生的纤维素酶实质为多种酶的混合物，其包含多种纤维素酶和半纤维素酶，如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶，还可以包括木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶等。不同的培养和/诱导底物，培养发酵纤维素酶真菌产生的纤维素酶活性和/纤维素酶混合物的活性(如对木质纤维素底物的降解活性)往往不同，如何利用一种纤维素酶产生真菌生产高效的纤维素酶混合物，也属于纤维素酶生产领域技术人员面临的问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述问题，本发明通过对现有技术的培养基(产酶培养基和补料培养基)和液体补料工艺进行优化调整，采用价格低廉固体的培养基，通过构建培养基中还原糖含量与补料基质之间的关系，不仅解决了以葡萄糖补料造成的CCR效应，而且提高了纤维素酶生产能力，并且提高了生产的纤维素酶活性(如对木质纤维素底物的降解活性)。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明公开了一种高效纤维素酶混合物的生产方法，所述方法包括：以里氏木霉或草酸青霉为纤维素酶生产菌进行发酵，整个发酵期间pH始终维持在3.5-6.5之间，发酵至48-60h，开始补料，补料后还原糖含量≤2.5mg/mL，每4-5h为一补料速率调整阶段，至结束发酵；

补料的培养基为：葡萄糖母液或木糖母液与硫酸镁、硫酸锌的混合液；

其中葡萄糖母液中，其成分包括：45～60％葡萄糖，15～30％的二糖及5～10％的多糖，其余为水；木糖母液中，其成分包括：45～70％木糖，5～20％葡萄糖，5～15％阿拉伯糖，其余为水；

所述补料培养基中还原糖浓度为20％～40％，硫酸镁浓度为0.5～1％，硫酸锌浓度为0.003～0.008％(上述百分比为质量体积百分比)。

上述二糖优选为麦芽糖。