[发明专利]IL28B基因位点多态性多通道荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及基于多通道荧光PCR法对IL28B基因位点多态性检测的试剂盒。

背景技术

丙型肝炎是一种世界范围内广泛流行的传染性疾病，据统计，全球目前有约1.8亿人曾感染过HCV病毒，约占人口总数的3％。丙型肝炎的传播方式主要为血液传播，此外针刺、吸毒等也是其常见的感染途径。目前诸多研究表明，丙型肝炎预后转归、接受抗病毒治疗的疗效与宿主IL28B基因多态性密切相关。

IL28B基因位于19号染色体上，由6个外显子和5个内含子组成，其编码产物IFN-λ3属于III型干扰素家族，参与抗病毒治疗的应答反应，从而影响HCV感染者自发清除病毒及接受干扰素治疗后的应答能力。在对不同人种丙型肝炎患者进行基因检测后发现：IL28B基因单核苷酸多态性位点rs12979860和rs8099917与持续病毒学应答显著相关。

文献指出，rs12979860是目前已知与HCV感染治疗后持续病毒性应答率(sustainedviralresponse,SVR)最为相关的指标，在接受标准治疗方案治疗过程中，携带C/C基因型的患者可获得更高的SVR，约是其它基因型的2～3倍，且C/C型比例越高，慢性丙型肝炎患者的病毒自发清除率越高。rs8099917位点基因型为T/T，T/G，G/G三种，其中T/T为保护性基因型，携带T/T基因型的患者比T/G和G/G型可以获得更好的抗病毒效果。因此，检测rs12979860和rs8099917位点多态性可以为临床提供参考，对患者的治疗起重要的作用。

目前临床上检测IL28B基因多态性的方法有很多，包括溶解曲线法、ARMS-PCR法、测序法等。溶解曲线法对仪器的温控性要求很高，要求仪器具有高分辨率溶解曲线分析(HRM)功能，而我们常用的荧光定量PCR仪一般缺少此功能；ARMS-PCR法需要对PCR产物进行电泳分析，不适于临床应用；测序法准确性高，但是仪器昂贵，操作较复杂耗时长，对操作者和实验场地要求较高。

中国专利《基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒》申请号为201510007333.1公开了一种基于实时荧光PCR的IL28B基因多态性检测试剂盒，两个多态性位点分别有一管反应液，即每个样本需要两管反应液检测，第一个缺点是每个样本需要占用两个反应孔从而使通量减半。第二个缺点是操作不便，若首先检测其中一个位点，则需严格按照样本原顺序检测另一位点，一旦出现样本遗漏或顺序错乱，则给结果判读造成很大麻烦；若按照每个样本同时检测两个位点操作，则在加反应液时要严格记录不同反应液的加样顺序，避免结果误判。另外，从其专利公布的附图可以看出，其纯合子的扩增曲线图存在明显的非特异性扩增，很容易判读为杂合子，这与引物探针的设计及探针发光基团和淬灭基团的选择存在较大关系，对于没有判读经验的操作人员来说很难准确判读结果。

因此，提供一种效率高、成本低、适于临床检测的试剂盒是目前亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种IL28B基因位点多态性多通道荧光PCR检测试剂盒以及IL28B基因位点多态性检测的引物和探针，该试剂盒可以专一地检测IL28B基因rs12979860和rs8099917位点多态性，一个PCR反应管内对这两个位点同时进行检测，明确具体基因型，且操作简便快捷，结果客观可控性强，效率高、成本低，闭管操作防污染，适用多通道荧光PCR仪，是临床上进行IL28B基因位点多态性检测的强有力产品。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种IL28B基因位点多态性检测的引物和荧光探针，以rs12979860和rs8099917位点为检测对象，设计特异性引物和探针，所述特异性引物包括用于扩增rs12979860的引物1，其序列如列表中SEQID:1和SEQID:2所示；用于扩增rs8099917的引物2，其序列如列表中SEQID:3和SEQID:4所示；所述探针包括用于特异性检测rs12979860的C/T基因型的探针1C和1T，其序列如列表中SEQID:5和SEQID:6所示；所述探针包括用于特异性检测rs8099917的T/G基因型的探针2T和2G，其序列如列表中SEQID:7和SEQID:8所示；所述探针还分别连接有荧光发光基团和荧光淬灭基团，其中，探针1C、探针1T、探针2T、探针2G的荧光发光基团分别为FAM、VIC、ROX、TAMRA；各探针的荧光淬灭基团均为Eclipse。

所述引物探针序列如下：