[发明专利]采用EST-SSR标记进行莲品种真伪和/或纯度鉴定的方法

说明书

本发明公开了采用EST‑SSR标记进行莲品种真伪和/或纯度鉴定的方法，属于农业生物技术工程领域。本发明方法包括如下步骤：以待检莲样品的基因组DNA作为模板，利用微卫星标记NL‑28、NL‑P8、NL‑35、NL‑1、NL‑P9和NL‑47的引物进行PCR扩增，构建指纹图谱，根据指纹图谱进行莲品种真伪鉴定和/或纯度检验。各微卫星标记引物序列如SEQ ID NO.1‑12所示。本发明所用的6个标记具有带型清晰、重复性好、可靠性强等特点；本发明的检测方法在4小时之内即可完成品种真伪、纯度鉴定工作，具有高效、准确、低成本和操作简便等优势。

技术领域

本发明属于农业生物技术工程领域，具体涉及一种采用EST-SSR标记进行莲品种真伪和/或纯度鉴定的方法。

背景技术

莲(Nelumbo nucifera)是一种多年生宿根草本水生蔬菜，属于双子叶植物睡莲科莲属，又称为荷、鞭蓉、芙蕖及水芙蓉等。莲一般种植在河湾、湖沼及池塘中，在我国许多地区均有分布，南方地区的水域中较多，其中长江中下游地区的品种最为丰富。莲是一种很古老的植物，其起源在冰川期以前，是没有被冰川灭绝而存活下来的孑遗植物中的一员(邹喻苹，蔡美琳，王晓东，等.古代“太子莲”及现代红花中国莲种质资源RAPD分析[J].植物学报，1998，40(2):163～168.)。亚洲莲具有很强的观赏性(如花莲)，同时具有食用价值(如藕莲)和药用价值(如子莲)。其实莲几乎所有的部分都可以入药，不光是莲子，莲花、莲藕和莲叶均具有减肥、抗炎、清热解毒、抗氧化、利肝保肝和清除自由基的效果。

微卫星标记是近些年快速发展起来的一种基于特异性引物PCR的分子标记，简单重复序列也被称为微卫星DNA(Microsatellite DNA)，这种微卫星DNA是普遍存在于真核生物基因组中的，一般由一到六个核苷酸组成的串联重复序列。与其他分子标记相比，微卫星标记具有如下优点：(1)数量极其丰富，均匀覆盖于整个基因组中，多态性比率高，同一物种的不同个体也有较高的多态性；(2)检测手段简单，结果稳定性和重复性都很好；(3)具有共显性，可以区分纯合子和杂合子，揭示完整的遗传信息，符合孟德尔遗传规律；(4)SSR位点是多等位基因，可以提供大量的遗传信息；(5)由设计的引物来决定位点，便于不同实验室之间进行交流和研究。由于上述优点，微卫星标记是一种非常理想的分子标记，已经被广泛地应用于基因的快速定位、指纹图谱和遗传图谱的构建以及分子标记辅助选择育种等研究。

品种的真伪、种子的质量和纯度鉴定对作物和蔬菜生产有着极其重要的意义(乔军，刘富中，陈钰辉，等.园艺作物果形遗传研究进展[J].园艺学报，2011，38(7):1385-1396.)。目前我国的种子纯度鉴定方法分为形态学鉴定和分子标记鉴定(郭健，尹利，张雅慧.玉米杂交种子纯度的SSR检测与田间鉴定的比较研究[J].内蒙古农业科技，2008(6):37-40.)。形态学鉴定的方法，不但时间长、消耗大，而且很容易受到环境因素的影响，无法快速准确地进行品种纯度鉴定。利用分子标记进行品种纯度鉴定的方法，为这一鉴定提供了时间短、成本低、不受环境因素和发育阶段影响的、准确可靠的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用EST-SSR标记进行莲品种真伪和/或纯度鉴定的方法，此方法具有多态性高、遗传稳定和不受环境条件影响等优点，可以弥补现有纯度检测工作的不足，从而为莲品种真伪鉴别和纯度的快速鉴定建立起高效准确的质量控制方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

采用EST-SSR标记进行莲品种真伪和/或纯度鉴定的引物，为序列如下所示的6对引物：

标记NL-28正向引物：CATGTGTGCCTAAACATGCC，

标记NL-28反向引物：TGTGCTTCGCTAGCAAAATG；

标记NL-P8正向引物：CTTCGCAGAGTTCATCCACA，