[发明专利]一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种无血清培养基及其制备方法，具体涉及一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

猴胚胎肾上皮细胞（Marc-145）是上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA104细胞）克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞主要用于病毒的培养，特别是猪繁殖与呼吸障碍综合病毒（PRRSV）对此细胞尤为敏感。

猪繁殖与呼吸障碍综合征是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）引起，以成年猪生殖障碍、早产、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常为特征的传染病，是一种免疫抑制病，常常继发其他病原感染。目前，该病在全世界几乎所有养猪地区都已流行，给世界养猪业造成了巨大的经济损伤。我国高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征的预防采用弱毒疫苗或者灭活疫苗进行预防。PRRSV的增殖对细胞有严格的选择性，其中Marc-145细胞对PRRSV敏感性强，病毒可以达到很高的滴度，因而广泛应用于高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的灭活疫苗或者活疫苗生产。

现有的Marc-145细胞培养过程中，通常需要加入8-10％的牛血清进行培养。如公开号为CN102002482A的发明专利申请文件，公开了一种猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法，其中公开了细胞生长液的配方：体积百分含量为90-92％的DMEM溶液、8-10％的牛血清、1％的双抗、1％的谷氨酰胺；公开号为CN101748101A的发明专利申请文件，公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒的生产方法，其中公开了生长液为添加10％新生牛血清的DMEM培养液。

血清能为细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入血清替代成分，制备得到的培养基既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。研发一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，可有效降低后续病毒纯化的分离难度，同时也可有效提高疫苗的安全性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能促进Marc-145细胞快速生长和增殖，不含血清，动物源成分含量低的培养Marc-145细胞用的无血清培养基及其制备方法。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种培养Marc-145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子0.1~10μg/mL、表皮生长因子5~20μg/mL、成纤维生长因子0.1~10μg/mL、转铁蛋白5~20μg/mL、亚硒酸钠20~30μg/mL、小麦蛋白酶解物1~5mg/mL、1~5%体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺10~20μg/mL。

优选地，本发明提供的培养Marc-145细胞用的无血清培养基，包括基础培养基，还包括如下组分：胰岛素样生长因子5μg/mL、表皮生长因子10μg/mL、成纤维生长因子8μg/mL、转铁蛋白15μg/mL、亚硒酸钠25μg/mL、小麦蛋白酶解物4mg/mL、2%体积百分比的酶解明胶溶液和乙醇胺15μg/mL。

本发明所述的基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基和F12培养基中的一种或两种。优选地，所述的基础培养基包括DMEM培养基和F12培养基，其体积比为1：1。

优选地，本发明所述酶解明胶溶液为胰酶酶解明胶溶液，所述PBS溶液用超纯水配制而成。

相应地，本发明还提供所述的培养Marc-145细胞用的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：

S1：制备小麦蛋白酶解物；

S2：制备酶解明胶溶液；

S3：向基础培养基中，按所述浓度加入胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、转铁蛋白、亚硒酸钠、小麦酶解植物蛋白、酶解明胶溶液和乙醇胺，混匀，过膜除菌即得培养基。

优选地，所述小麦蛋白酶解物的制备方法包括如下步骤：取小麦蛋白粉，加入其重量15~20倍量纯化水，搅拌均匀，混悬液中加入8~10mol/LHCL调节溶液pH值为2.0~4.0，加入1200~1800U/g的酶，35~45℃下酶解6~10h，用1~2mol/LHCL或NaOH保持溶液pH值不变，酶解结束后95℃灭酶15~20min，冷却后离心取上清液，减压浓缩，减压干燥，即得小麦蛋白酶解物。