[发明专利]应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验的方法

权利要求书

1.一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实 验(ATAC-seq)的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)斑马鱼胚胎样本的准备：

取斑马鱼胚胎于离心管中，加预冷的PBS洗涤剂洗涤3次；

(2)斑马鱼胚胎细胞核获取：

加入预冷的裂解缓冲液200ul，用200ul广口的移液器枪头冰上反 复吹打，直至胚胎完全裂解，离心收集细胞核；

(3)转座反应和纯化：

立即加Tn5转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短 暂离心，37度水浴反应30min；转座结束后用QiagenMinEluteKit进 行纯化，10ul洗脱液洗脱，纯化后的DNA可于-20度保存；

(4)PCR扩增：

步骤(3)所得纯化DNA转入0.1mlPCR管中，加入上下游PCR 引物，SYBRGreenI，PCRMasterMix，PCR仪器中反应4个循环；上 述反应液取出5ul，依次再加入上述引物等，在实时荧光定量PCR仪中 反应19个循环，剩下的45ul反应液于冰上放置备用；

(5)文库构建及纯化：

根据实时荧光定量PCR结果来确定文库构建所有反应的循环数；实 时荧光定量曲线图线性化设置(Rn/Cycle)，RF阈值设为5000，循环 数的计算为1/4最大荧光值所对应的循环数为该样本建库所需要的循 环数；根据计算结果将步骤(4)剩下的45ul样品放入PCR仪中反应， 所得文库用AMPurebeads纯化后，通过bioanalyzer进行文库质量检测， Hiseq2500的125PE进行高通量测序，结果进行生物信息分析。

2.根据权利要求1所述的一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶 核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，其特征在于，步骤(2) 中，所述的裂解缓冲液具体包含：10mMTris-HCl，pH7.4，10mMNaCl， 3mMMgCl2，0.1％IGEPALCA-630；离心转速为500g，10min，4度。

3.根据权利要求1所述的一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶 核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，其特征在于，步骤(3) 所述的转座反应体系主要包括：25ul2*TDBuffer，2.5ulTn5转座酶， 22.5ul无核酶水(IlluminaCat#FC-121-1030)。

4.根据权利要求1所述的一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶 核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，其特征在于，步骤(4) 所述的PCR反应体系包括：10ul转座纯化后DNA，9.7ul无核酶水， 2.5ul25uMCustomizedNexteraPCRPrimer1，2.5ul25uMCustomized NexteraPCRPrimer2(Barcode)，0.3ul100*SYBRGreenI，25ul NEBNextHigh-Fidelity2*PCRMasterMix；具体反应条件为72℃5min， 98℃30sec，98℃10sec，63℃30sec，72℃1min，Repeatsteps3-5，4cycles， 保持在4℃；第二次PCR反应体系包括：5ul第一次PCR反应产物，4.44ul 无核酶水，0.25ul25uMCustomizedNexteraPCRPrimer1，0.25ul 25uMCustomizedNexteraPCRPrimer2(Barcode)，0.06ul100*SYBR GreenI，5ulNEBNextHigh-Fidelity2*PCRMasterMix；具体反应条件 为98℃30sec，98℃10sec，63℃30sec，72℃1min，Repeatsteps2-4，19cycles， 保持在4℃。

5.根据权利要求1所述的一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶 核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，其特征在于，步骤(5) 所述的建库PCR反应条件为98℃30sec，98℃10sec，63℃30sec，72℃ 1min，Repeatsteps2-4，xcycles，保持在4℃。