[发明专利]应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学实验技术领域，尤其适用于斑马鱼早期胚胎发育过程中染色质结构的变化及基因表达调控机制研究。

背景技术

越来越多的证据显示，许多遗传学差异并非影响基因，而是改变控制基因开/关的调控序列。活化的调控序列上结合有转录因子，转录因子是识别特定DNA序列的蛋白。一旦转录因子结合，就会招募其他蛋白，使附近的基因开始转录。在指定细胞中鉴定所有活跃的调控序列，对于理解基因组的作用机制非常重要。易接近转座酶核染色质高通量测序实验(AssayforTransposaseAccessibleChromatinusingsequencing，ATAC-seq)，通过Tn5转座酶，优先标记和测序核小体之间的DNA,获取全基因组上转录因子和核小体定位信息，其提供的信息与DNase-seq法差不多，但步骤更为简单，需要的细胞也更少。在无法获得大量细胞的情况下，ATAC-seq更有帮助。例如，在胚胎发育早期细胞量少，收集大量细胞难度大，成本高，用ATAC-seq检测早期胚胎发育过程中染色质的开放变化及转录因子结合序列，为研究基因表达调控提供依据。也可以在癌症组织或ips生成的细胞中，用ATAC-seq检测调控序列，此外，ATAC-seq也有望成为有用的诊断工具。

斑马鱼由于养殖方便，繁殖周期短，产卵量大，胚胎体外受精，体外发育，胚胎透明，研究发现斑马鱼共享了人类70％的蛋白编码基因，而且人类相关基因中有84％可以在斑马鱼中找到对应基因，已成为生命科学研究的新宠。利用斑马鱼可以研究生命科学的基础问题，揭示斑马和组织器官发育的分子机理；可以构建人类的各种疾病和肿瘤模型，建立药物筛选和治疗的研究平台等。

目前ATAC-seq技术只是用于细胞样本中，还未有报道在斑马鱼的胚胎细胞中应用。本方法针对斑马鱼胚胎进行了改良，以利于对胚胎发育过程中染色质结构的变化及与基因表达的关系进行研究，为揭开人类发育的神秘面纱提供依据。

发明内容

本发明的目的就是为了研究斑马鱼早期胚胎发育过程中的染色质开放的变化及与基因表达调控的关系所建立的一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，该方法包括以下步骤：

(1)斑马鱼胚胎样本的准备：

取斑马鱼胚胎于离心管中，加预冷的PBS洗涤剂洗涤3次；

(2)斑马鱼胚胎细胞核获取：

加入预冷的裂解缓冲液200ul(10mMTris-HCl，pH7.4，10mMNaCl，3mMMgCl2，0.1％IGEPALCA-630)，用200ul广口的移液器枪头冰上反复吹打，直至胚胎完全裂解，4度，转速500g，10min离心收集细胞核。

(3)转座反应和纯化：

立即加Tn5转座酶及TD转座缓冲液进行转座反应，轻轻涡旋后短暂离心，37度水浴反应30min。转座反应具体包含：25ul2*TDBuffer，2.5ulTn5转座酶，22.5ul无核酶水(IlluminaCat#FC-121-1030)。转座结束后用QiagenMinEluteKit进行纯化，10ul洗脱液洗脱，纯化后的DNA可于-20度保存；

(4)PCR扩增：