[发明专利]用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待鉴别的大闸蟹肠道中微生物全基因组DNA，得到DNA模板；

(2)聚合酶链式反应，以扩增大闸蟹肠道微生物的16SrDNA序列，所述聚合酶链式反应使用的引物包括以下三种序列DNA引物：

Fus：上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2；

Fuse:上游引物SEQIDNO.3和下游引物SEQIDNO.4；

Ign:上游引物SEQIDNO.5和下游引物SEQIDNO.6；

(3)PCR产物进行电泳，将PCR产物的电泳图谱与阳澄湖大闸蟹特有细菌的电泳图谱进行比较，若PCR产物的电泳图谱与阳澄湖大闸蟹的特有细菌电泳图谱相一致，则该大闸蟹为阳澄湖大闸蟹。

2.根据权利要求1所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于：所述阳澄湖大闸蟹特有细菌选自Fusobacterium或Ignatzschineria。

3.根据权利要求1所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于：在步骤(2)中，聚合酶链式反应具体为：94℃预变性5分钟，然后按照以下条件进行30次循环扩增反应：94℃变性30秒、退火30秒及72℃延伸30秒，扩增反应结束后72℃延伸10分钟。

4.根据权利要求3所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于：当引物为Fus时，PCR退火温度为57℃，产物为350bp；当引物为Fuse时，PCR退火温度为50℃，产物为198bp；当引物为Ign时，PCR退火温度为48℃，产物为230bp。

5.根据权利要求1所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于，聚合酶链式反应体系为：DNA模板1μl，10μmol/L的正向及反向引物2μl，TaqDNA聚合酶2U，2.5mmol/LdNTP 4μl，10×PCR缓冲液5μl，超纯水补充至20μl。

6.根据权利要求1所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于，步骤(1)提取待鉴别的大闸蟹肠道中微生物全基因组DNA具体包括：

(a)提取大闸蟹肠道组织：取肠道并在低温下研磨成粉末状，置于无菌离心管中；

(b)向上述无菌离心管中加入裂解液I、10％溶菌酶和1％RNase，混匀后于37℃保温30分钟，其中所述裂解液I包括150mmol/L NaCl和100mmol/LEDTA·Na2，pH值为8.0；

加入裂解液II、20％SDS和20％PVPP，混匀后冰浴5分钟，所述裂解液II包括100mmol/LNaCl和500mmol/L Tris-HCl，pH值为8.0；

加入处理液I，13000g离心8分钟，取上清液，所述处理液I为Tris-饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1的混合液；

再加入处理液II，13000g离心8分钟，取上清液，所述处理液II为氯仿:异戊醇＝24:1的混合液；

加入异丙醇和醋酸钠，-20℃沉淀2小时，离心后用去离子无菌水溶解沉淀，-20℃冷冻保存备用。

7.根据权利要求6所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于：以肠道组织为基准，所述裂解液I、裂解液II、处理液I和处理液II的用量均为每克样本1mL。

8.根据权利要求1所述的用于鉴别阳澄湖大闸蟹的方法，其特征在于：在步骤(3)中，电泳的条件为：1％浓度琼脂糖，120V电泳30分钟。