[发明专利]一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法

权利要求书

1.一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，包括：

S1、采用SMRT流程对原始环状测试序列进行去接头合并，形成单分子转录本序列，并从所述单分子转录本序列中筛选出三代全长转录本序列；

S2、利用二代测序数据对筛选出的三代全长转录本序列进行纠错；

S3、将纠错后的三代全长转录本序列对比至参考基因组序列，筛选出与参考基因组序列对比的覆盖率和相似度均大于预设阈值的三代全长转录本序列；

S4、对筛选出的三代全长转录本序列进行剪切假阳性过滤以及DNA污染过滤；

S5、将过滤后的三代全长转录本序列进行基因注释以及可变剪切体注释；

S6、根据三代全长转录本序列的基因注释以及可变剪切体注释，将单外显子序列重叠或者多外显子序列所有剪切位点一致的三代全长转录本序列认定为同一基因模型；

S7、对同一基因模型进行去冗余及假阳性过滤；

将去冗余及假阳性过滤后的三代全长转录本序列与参考基因组序列的已注释基因位点重叠度达到20％的序列认定为同一基因下的转录本序列；

将三代全长转录本序列与参考基因组序列的已注释基因位点的重叠度小于20％的序列认定为新基因序列；

将三代全长转录本序列与参考基因组序列的已注释基因位点的重叠度大于20％，但基因方向不一致的序列认定为新基因序列；

将三代全长转录本序列与参考基因组序列的已注释基因位点相比，出现3’剪切位点发生改变或者出现新的内含子或者出现新的外显子的序列认定为新同源异构体序列。

2.如权利要求1所述的三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，所述预设阈值为90％。

3.如权利要求1所述的三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中对筛选出的三代全长转录本序列进行剪切假阳性过滤具体包括：

解析三代全长转录本序列中cDNA序列的方向，将cDNA序列中为反向方向或者无法确定序列方向的多外显子转录本序列筛除；

从未被筛除的多外显子转录本序列中筛选出内含子为GT-AG结构的序列，当多外显子转录本序列的内含子不为GT-AG结构，且不被二代测序数据支持时，筛除该多外显子转录本序列。

4.如权利要求1所述的三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中对筛选出的三代全长转录本序列进行DNA污染过滤具体包括:

挑选出未被基因注释的单外显子比对序列，判断所述单外显子比对序列在参考基因组序列上对应位置的上下游是否有富集的碱基A或者碱基T，若有，则对该单外显子比对序列进行DNA污染过滤。

5.如权利要求4所述的三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，所述判断单外显子比对序列在参考基因组序列上对应位置的上下游是否有富集的碱基A或者碱基T具体包括：

以单外显子比对序列在参考基因组序列上匹配的起始位点为中心分别取其上下游各30bp，共60bp，以及以单外显子比对序列在参考基因组序列上匹配的终止位点为中心分别取其上下游各30bp，共60bp；

以15bp为kmer大小，将起始位点对应的60bp以及终止位点对应的60bp划分为92个kmer；

统计每个kmer中的碱基T或者碱基A的数目，并筛选出所有kmer中碱基T或者碱基A的最多数目m，定义m/15为该单外显子比对序列的A/T丰度；

若单外显子比对序列的A/T丰度达到80％，则判定单外显子比对序列在参考基因组序列上对应位置的上下游有富集的碱基A或者碱基T，否则，没有富集的碱基A或碱基T。

6.如权利要求1所述的三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，所述步骤S7具体包括：

判断同一基因模型是否存在5’端缺失，若是，则将该三代全长转录本序列筛除；

若基因模型中只有一条smart序列，且该序列的所有内含子不被二代测序数据支持，则将该条序列筛除；

同一基因模型保留最长的一条三代全长转录本序列。

7.如权利要求6所述的三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，其特征在于，将新基因序列以及新同源异构体序列添加到参考基因组序列中，以完善基因模型注释。