[发明专利]一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法

说明书

本发明公开了一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，包括对原始环状测试序列进行去接头合并，形成单分子转录本序列，并筛选出三代全长转录本序列；将三代全长转录本序列对比至参考基因组序列，筛选出与参考基因组序列的覆盖率和相似度均大于预设阈值的三代全长转录本序列；对筛选出的三代全长转录本序列进行剪切假阳性过滤以及DNA污染过滤；对过滤后的三代全长转录本序列进行基因注释以及可变剪切体注释。本发明中提及的三代测序技术所具有的超长读长足以覆盖绝大多数RNA，采用SMRT测序转录组不需组装就能够得到全长转录本序列，利用三代转录组测序能有效获取基因的剪切结构并且能够构建更加完善的基因模型注释。

技术领域

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法。

背景技术

目前已有的转录本与基因组比对软件GMAP(GMAP：一种序列比对软件)能够直接输出flnc(flnc：非嵌合型的全长转录本)的基因模型gff文件(gff：一种对碱基序列特征进行描述的数据格式)，但是对比结果是针对每条序列的比对信息，若直接用此结果作为基因注释结果存在过多的假阳性及重复：1)整体上的覆盖度及比对率无法保证剪切位点的准确性，而三代测序获取的转录本中存在的错误大部分为缺失插入(indel)，外显子边界附近的indel极易造成剪切位点的定位错误；2)由于基因的多次表达，许多序列会对应到同一基因模型，基因注释结果中存在大量冗余。

与参考基因组的注释结果比对并合并的软件Cufflinks能将两组注释结果进行比较，能找出相对于参考序列reference注释equal(表示与参考序列已经注释的基因一致的基因)、novel(表示与参考序列已经注释的基因比较后，发现为新基因)、contained(表示与参考序列中已经注释的基因相比，包含在已注释基因中，但是序列长度短于已经注释的基因)等的基因或者isoform(可变剪切体)，contained中包含相对reference有5’或者3’缺失的基因结构，由于Isoseq(三代转录组测序的流程称作Isoseq)实验过程能保证3’的完整性，所以3’缺少外显子对应的也是个新的isoform(可变剪切体)，而5’外显子缺失很可能为实验过程中的分解导致，因此contained部分中即存在novel的，也存在非全长的，而cuffdiff本身没有将其区分开。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，能够克服现有技术中的缺点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

本发明提供了一种三代全长转录组中可变剪切体的检测方法，包括：

S1、采用SMRT流程对原始环状测试序列进行去接头合并，形成单分子转录本序列，并从所述单分子转录本序列中筛选出三代全长转录本序列；

S2、利用二代测序数据对筛选出的三代全长转录本序列进行纠错；

S3、将纠错后的三代全长转录本序列对比至参考基因组序列，筛选出与参考基因组序列对比的覆盖率和相似度均大于预设阈值的三代全长转录本序列；

S4、对筛选出的三代全长转录本序列进行剪切假阳性过滤以及DNA污染过滤；

S5、将过滤后的三代全长转录本序列进行基因注释以及可变剪切体注释。

本发明的有益效果为：三代测序的超长读长完全覆盖绝大多数RNA，采用SMRT测序技术对转录组进行测序不需要组装就能够得到全长转录组序列，利用三代转录组测序能有效获取基因的剪切结构并且能够构建更加完善的基因模型注释，对于基因剪切模式比较复杂的物种，三代转录测序优势更加突出；对三代全长转库本序列进行剪切假阳性过滤以及DNA污染过滤，完善基因模型注释，提高基因模型的可信度，得到精准的基因模型。

在上述技术方案的基础上，还可以作如下改进。

进一步的，所述预设阈值为90％。