[发明专利]用于鉴定安吉小鲵的多重PCR引物和方法及应用

说明书

本发明公开了一种用于鉴定安吉小鲵(Hynobius amjiensis)的多重PCR引物和方法及应用，其中，所述多重PCR引物包括如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示的引物对1，以及如SEQ ID No：3和SEQ ID No：4所示的引物对2。通过上述方案，从安吉小鲵成体、蝌蚪或是卵带等组织中提取其DNA，利用本发明提供的两对PCR引物对，根据琼脂糖凝胶电泳检测中是否出现两条条带来对安吉小鲵进行特异性鉴定，避免了常规DNA测序及序列比对等繁琐步骤，实现了仅需通过一次PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测即可鉴定安吉小鲵，检测时间短，操作简便且实际使用时更为经济而高效的效果。

技术领域

本发明涉及生物物种的检测领域，具体地，涉及一种用于鉴定安吉小鲵的多重PCR引物和方法及应用。

背景技术

安吉小鲵(Hynobius amjiensis)隶属两栖纲(Amphibia)、有尾目(Caudata)、小鲵科(Hynobiidae)、小鲵属(Hynobius)，是中国特产的珍稀两栖动物。安吉小鲵直到1991年才被发现定名(顾辉清，1991)，其模式标本产地位于浙江省安吉县龙王山省级自然保护区(Guand Lau，2004)。安吉小鲵一般均栖息在海拔1300米以上的高山湿地、草甸中，繁殖季节时进入附近的溪流源口处、小溪沟或水坑内配对产卵，繁殖期后营陆栖生活。由于安吉小鲵的分布区极度狭窄，其野外种群数量估计不足300只，处于极度濒危的境地(顾辉清等，1999)。自2000年被国家林业局列入《国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物名录》后，安吉小鲵在2004年被IUCN红色物种名录列为极危(CR)级物种。2010年，在国家林业局发布的《极度濒危陆生野生动物名录》中，安吉小鲵又被列在首位。国内外很多学者均呼吁应加强对该物种的保护和研究(傅萃长，2003；Gu and Lau，2004；杨莉等，2008)。

基于分类学的准确物种鉴定是人类认知自然和可持续发展的必要前提。它为生物多样性的保护、物种资源的可持续性利用，以及生物来源的新产品开发等提供了知识和理论基础(肖金花等，2004)。对于物种的鉴定，传统的方法主要是采用形态学证据来进行。但该方法的一些缺陷也造成了濒危动物保护工作的局限，例如表型可塑性和遗传可变性、无法区分隐存分类单元、受生物性别和发育阶段限制等(李明等，2001)。在野生动物保护的实践工作中，一些来源不明的动物样品(如毛发、残肢、腐败组织、骨骼、皮张及粪便等)往往不完整且样品量较小，已很难从形态学上加以识别。然而，物种鉴定的结果往往又是林业、工商、边检等执法部门开展野生动物资源保护与管理工作的基础。另一方面，由于这些动物大都生活在高山密林、人迹罕至处，或由于气候等客观原因，保护工作者极少有机会能亲眼观察到它们，以致进一步开展基于物种DNA数据的种群数量、种群遗传等工作困难重重。

具体到安吉小鲵物种，由于其平时均生活于湿地草甸泥炭藓下腐植质层中，只有在冬季产卵季节才进入水坑。因此，在实际野外保护工作中很难看到安吉小鲵，绝大多数情况下遇到、采集到的都是其繁殖期内的蝌蚪、卵袋等未变态的幼体。同时，安吉小鲵的栖息地内同时还生活着其它两栖动物，如东方蝾螈、无斑肥螈、各种蛙类等。这些动物的幼体(蝌蚪期或卵袋期)还存在着生态位的重叠现象。安吉小鲵刚从卵袋里孵化出来的时候通体黑色个体又非常幼小，与同一水域内其它两栖类动物的蝌蚪非常相似，极难辨认。繁殖期幼体安吉小鲵难以辨识的情况给安吉小鲵的种群遗传学、迁地保护等工作带来了极大困难。