[发明专利]一种灵芝菌种提纯复壮的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌种选育技术领域，尤其是一种灵芝菌种提纯复壮的方法。

技术背景

灵芝是一种广泛培植的重要药用真菌，生产用菌种同其他微生物一样存在着退化问题。目前，我国灵芝各培植基地生产用的第一代母种基本都是引进的，引进的一级母种种性优良，在之后多次转接原种、生产种时，培养基的组分皆由80％～85％木屑、15％～20％麦麸或米糠构成，没有充分考虑灵芝菌种在培植生产的不同阶段对营养需求的变化，在两代过后，灵芝生长不断弱势，抗逆性差，最终导致种植户减产甚至绝产。

目前，灵芝培植生产时表现为：

第一代(年)：菌丝吃料很快、培养基菌丝始终粗壮洁白、生长周期长、产量高品质高、生物转换率都能≥5.3％，而且抗逆性很强，即使在普通种植户的简陋接种养菌条件环境，或村庄人畜生活附近的不够清洁环境培植场地，也能达到污染报废率为零或极少，污染率≤1％；

第二代(年)：引进的母种经继代保存，或组织分离的，菌丝吃料快或较快、培养基菌丝生长始终比较粗壮洁白、生长周期较长、产量高品质好、生物转换率能达到5％，抗逆性较强、污染率低于≤3％；

第三代(年)：引进的母种再继代保存或组织分离的，菌丝吃料变慢、培养基菌丝生长不够粗壮、洁白持续的时间减短、生长成熟周期缩短、产量与品质比较好、生物转换率4.5～4.9％、抗逆性较弱、生产种和培养基菌木污染报废率达5～10％，约5％左右的子实体背面出现有坏死斑块；

第四代、第五代(年)及以后：母种为再继代保存或组织分离的，菌丝吃料缓慢、培养基菌丝生长细弱、40日龄以上的菌丝通常变为棕色斑块、生长成熟周期大大缩短，从原种、生产种到培养基菌木均常常出现——培养基料表面尚有1/3、1/4甚至1/2的面积菌丝迟迟未能吃到位，而接种点就长出子实体了。一经脱袋覆土后的培养基菌木污染报废率大多高达30％以上，生物转换率均降低到4.3％以下，每每不乏绝收。而每当此时一般只能依靠再引进“新”母种，来提高灵芝生产的生物转换率、降低污染报废率，增加了生产成本。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的在于克服现有技术中灵芝菌种经多次继代培养后生物转换率低、污染报废率大幅增加的问题，从而提供一种灵芝继代培养后仍然稳定高产、抗逆性强、菌棒生物转化率≥5％的灵芝菌种提纯复壮的方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案，一种灵芝菌种提纯复壮的方法，包括以下步骤：

(1)菌种的初次筛选培养：采用三代及三代以内的健壮的灵芝个体组织分离提取母种，以琼脂、或小米配合马铃薯为培养基，常规斜面培养10～15天，再置于超低温-80～-50℃保藏；

(2)第二次培养：选取步骤(1)培养的灵芝菌种，以小米粉与栎树叶汁为培养基，常规斜面培养10～15天，再进行超低温保藏；

(3)第三次培养：选取步骤(2)培养的灵芝菌种，以小米粉与栎树叶粉为培养基，常规斜面培养10～15天，再进行超低温保藏；

(4)第四次培养：选取步骤(3)培养的灵芝菌种，以栎树叶粉、Vb1和水为培养基，常规斜面培养，当菌丝生长满试管时停止培养，再进行超低温保藏；

(5)扩展原种：选取步骤(4)培养的灵芝菌种，以栎树木屑、麦麸或米糠的混合物为培养基，使用广口瓶、棉塞常规培养18～25天，然后更换棉塞为四层医用纱布封罩瓶口，继续培养10～20天并保藏；

(6)扩转生产种：选取步骤(5)培养的灵芝菌种，以栎树木屑、麦麸或米糠的混合物为培养基，经蒸汽灭菌、分袋、接种，并加扎外袋罩护，常规培养，当接种孔发菌直径8～10cm后覆膜去外罩护袋，继续常规培养一共培养30～40天并保藏；

(7)应用生产：将步骤(6)培养的灵芝菌种用于车间规模化生产。

进一步地，所述步骤(2)第二次培养所用的培养基组分质量比为小米粉：栎树叶汁＝(2.6～3.5):l，优选为小米粉：栎树叶汁＝3:l。

进一步地，所述步骤(3)第三次培养所用的培养基组分质量比为小米粉：栎树叶粉＝(0.5～1.5):l，优选为小米粉：栎树叶粉＝1:l。

进一步地，所述步骤(4)第四次培养所用的培养基的质量组分为：栎树叶粉800～1200份、Vb10.03～0.07份、水1300～1700份，优选为：栎树叶粉1000份、Vb10.05份、水1500份。

进一步地，所述步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)中使用试管、棉塞常规斜面培养，当菌丝离试管底端距离为3～7mm时停止培养。