[发明专利]用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法

说明书

本发明涉及一种用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，所述的双酶制备法包括：用复合固定化材料同时固定化两种基因工程菌菌体，其中所述的两种基因工程菌菌体为酰化消旋酶工程菌与L‑氨基酰化酶工程菌，或者酰化消旋酶工程菌与D‑氨基酰化酶工程菌；以滴落形式将所述的复合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化细胞，将渗透交联的固定化细胞进行消旋和水解反应，转换乙酰化‑DL‑氨基酸为手性D‑氨基酸和手性L‑氨基酸。采用了该发明中的用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，其技术效果在于，一步法得到手性非天然氨基酸，其中生产材料安全易得，生产方法简单，生产效率高，操作简便，适合大规模生产手性非天然氨基酸，易于推广使用。

技术领域

本发明涉及生物化学领域，尤其涉及氨基酸的生产方法，具体是指一种用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法。

背景技术

非天然氨基酸是众多药物尤其是近10年来新药的核心中间体。众所周知，早期头孢类药物广泛使用非天然氨基酸D-苯甘氨酸和D-对羟基苯甘氨酸作为核心中间体，近20年来，越来越多的药物广泛使用非天然氨酸作为药物的核心中间体，如左乙拉西坦使用L-2-氨基丁酸，培哚普利使用L-正缬氨酸，达泊西汀使用L-3-苯丙氨酸，依那普利、贝那普利、群多普利使用L-高苯丙氨酸，正在三期临床的诺华的超级降压药物LCZ696使用L-2-(4-联苯)基丙氨酸。

非天然氨基酸的生产工艺主要有不对称合成法、化学拆分法和生物酶催化法，其中不对称合成法由于手性催化剂和手性辅助试剂比较昂贵，目前尚不能够广泛用于工业化生产；化学拆分法因为原料消耗大，污染大，手性含量低，逐渐不符合目前清洁生产的要求；生物酶催化法具有立体选择性高、反应条件温和、手性含量高、产品系列化、污染少等优点，是以后非天然氨基酸工业生产技术的发展方向。

在酶法生产非天然氨基酸的工艺中，氨基酰化酶是主要使用的酶和工艺；目前已经商品化L-氨基酰化酶和D-氨基酰化酶，但是目前该酶法理论转化率只有50％，只能够得到一种手性异构体，存在着成本高的问题；近年来研究发现，在生物体内存在酰化消旋酶，可以消旋L-和D-乙酰化氨基酸，因此有人将两种酶结合起来使用生产非天然氨基酸，但是众多文献均存在手续繁杂，不利于工厂生产，如何进一步简化工艺，提高收率，降低成本，依然是该双酶法工艺存在的问题，制备固定化菌体是一个发展方向。

聚乙烯醇是一个优良的固定化细胞的材料，具有强度高、化学稳定性好、价格低廉的特点，但是单独使用聚乙烯醇作为固定化材料，有细胞毒性高、不易制备球形颗粒、凝固速度慢的特征。明胶也为固定化细胞的常规原料，但是存在酶活性低的特征。

固定化细胞与固定化酶不同，细胞存在细胞酶，酶在细胞内，转化底物和产物，均需要通过细胞膜，因此存在细胞膜的通透性问题。固定化细胞比游离细胞通透性更差，如何提高固定化细胞的通透性，也是一个研究方向。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术的缺点，提供了一种能够用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法。

为了实现上述目的，本发明的双酶制备法具有如下构成：

该用于工业化生产手性非天然氨基酸的双酶制备法，其主要特点是，所述的双酶制备法包括：

(1)用复合固定化材料同时固定化两种基因工程菌菌体，其中所述的两种基因工程菌菌体为酰化消旋酶工程菌与L-氨基酰化酶工程菌，或者酰化消旋酶工程菌与D-氨基酰化酶工程菌；以滴落形式将所述的复合固定化材料滴入固定化液中，得到固定化细胞；

(2)将所述的固定化细胞渗透交联，提高所述的固定化细胞的比活力；

(3)在生物反应器中将渗透交联的固定化细胞进行消旋和水解反应，转换乙酰化-DL-氨基酸为手性D-氨基酸和手性L-氨基酸。

优选地，所述的复合固定化材料为聚乙烯醇和明胶的复配材料，聚乙烯醇与明胶的比例为20：0.8～1.6。