[发明专利]一种用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在口蹄疫病毒增殖中的应用

说明书

本发明公开了一种用于BHK‑21细胞高密度悬浮培养的低血清培养基及其在口蹄疫病毒增殖培养中的应用。本发明通过研究BHK‑21细胞生长过程中葡萄糖等营养物质的代谢水平和相互调节，提出了个性化BHK‑21细胞低血清培养基，包含氨基酸部分、维生素部分、平衡盐部分和其它添加物部分。使用本发明培养基用于BHK‑21细胞的高密度悬浮培养，能够大大提高细胞对营养物质的有效利用率，降低代谢副产物浓度，从而提高细胞培养效能；此外，采用本发明培养基培养获得的BHK‑21细胞，对FMDV不同血清型敏感性增加，病毒有效抗原146S含量得到大幅度提高，可达到细胞生长的高效性、细胞生长的可控性及代谢副产物浓度最低化的目的，使生物制品的生产效率更高，生产成本更低，具有显著的经济效益。

技术领域

本发明涉及一种BHK-21细胞全悬浮高密度低血清个性化培养基的研制及其在口蹄疫病毒增殖中的应用，属于兽用生物制药领域。

背景技术

随着生物制品技术的快速发展，我国现行口蹄疫灭活疫苗生产工艺，从使用传统的转瓶贴壁细胞培养，发展为生物反应器大规模细胞悬浮培养。利用生物反应器进行大规模细胞培养，可以大幅度提高规模化动物细胞培养的单位产量，实现细胞的高密度培养、高密度表达，同时可以简化生产工艺，降低生产成本，保证大规模生产的产品质量。而普通培养基无法满足反应器中细胞的高密度培养，也不能够支持反应器独特的培养方式。在国外个性化培养基已成为培养基发展的主流，已被普遍使用并产生极大的经济效益。适宜的培养基配方可提高细胞的培养密度和细胞活率，提高病毒产量。因此如何根据规模化细胞培养工艺的不同，研发个性化培养基，提高目标产品的稳定性、产出率，是目前本领域的研究热点和难点。

本发明根据现有的细胞株、细胞培养方式，目的产物及生产工艺，细胞代谢及营养物质的需求，确立培养基设计方案，建立各种营养物质的检测方法，分析细胞代谢流，设计培养基配方，与商业化培养基比较，血清含量降低30％，细胞对营养物质的有效利用率提高，代谢副产物浓度降低，提高了BHK-21细胞的培养密度和细胞活率，细胞产能增加28％，经口蹄疫病毒增殖，细胞对FMDV不同血清型敏感性增加，抗原含量稳定且提高幅度达43％，从而保证在稳定的细胞培养过程下，兼顾培养细胞的高密度水平和生产病毒抗原的高浓度，生产高质量的病毒疫苗，为目标产品品质的提高和产业化生产奠定了基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种低成本、成分较为明确的适用于BHK-21细胞高密度悬浮培养的低血清个性化培养基。

本发明的目的之二是提供所述培养基在BHK-21细胞高密度悬浮培养中的用途。

本发明的目的之三是提供所述培养基在病毒增殖中的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

1、研制培养基策略方法由以下步骤完成：

(1)、细胞基础培养液的配制与准备

称取MEM培养基粉末溶于一定量蒸馏水(蒸馏水温度低于40℃)中，充分搅拌溶解，用氢氧化钠或盐酸调节pH值至6.95～7.15，最后定容即得BHK-21细胞悬浮培养用培养基。

(2)、细胞复苏与培养

从悬浮BHK-21细胞工作库取细胞一支，复苏后静置培养于T100细胞方瓶内，传2～3代，细胞长满单层后用胰蛋白酶消化，补加适量细胞培养液转移至1000ml三角瓶中，37℃振荡悬浮培养，摇床转速为90r/min，pH值为7.0～7.2，每日用NaHCO₃调pH值。待细胞培养体积达到规定数量后，收集细胞，转入5L生物反应器中培养，培养设定参数：温度为37.0～37.5℃，pH值为7.0～7.2，DO值为60.0％～80.0％，搅拌转速为80～120r/min，培养50h传代培养。

(3)、BHK-21细胞在基础培养基中细胞生长代谢参数的控制