[发明专利]空间转录组建库测序方法及所用装置

说明书

技术领域

本发明涉及生物学、医学、农学等领域，尤其是一种利用芯片探针获取组织细胞空 间位置信息的空间转录组建库测序技术。该技术可以根据细胞的位置，类别以及状态信息 对细胞进行准确的、可重复的标记和分类，可以在保留细胞组织中的位置分布的从自然组 织微环境下的活细胞中分离出RNA，通过高通量测序和生物信息分析等流程，一次性定量获 得不同空间位置组织细胞的完整的表达谱。

背景技术

转录组是特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的集 合。转录组测序即对特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有mRNA进行测序。通过 新一代高通量测序，转录组测序能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态 下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。细胞 是生命活动的基本功能单位，而在生物体内没有任何两个细胞是完全相同的。传统的转录 组研究，绝大多数情况下都是针对混合的大量细胞进行的，无法观察到单个细胞之间细微 的差别，掩盖了独立个体样本的行为以及生命现象中特异性和细胞差异性。而针对单个细 胞的研究，是细胞生命分析技术所追求的极限状态，是对传统技术发展的终极挑战。目前我 们正在步入一个单细胞转录组学时代，该研究方向会对生物学和医学产生深刻的影响。然 而单细胞基因组及转录组测序所需要的测序样本量要比单细胞中本身所含有的基因组及 转录组分子高出好多个数量级，所以这对核酸扩增技术(amplificationtechnology)也是 一大考验。而且目前采用的单细胞测序技术中，绝大多数方法都需要特定的前处理过程，制 备“测序文库”。面对如此微量的分子，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序质量带来 非常严重的影响。而且多重扩增又容易带来试验误差，比如基因组或转录组覆盖不均一、操 作失误率高、重复性差、背景噪声以及定量不准确等问题均造成单细胞测序难以广泛应用 和推广。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于组织和芯片空间位置信息的、操作简 便、成本相对较低、特异性强、分辨率高、便于检测特定组织特定细胞基因转录表达信息的 空间转录组建库测序技术。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于组织和芯片空间位置信息的空间转 录组测序技术装置：包括盖玻片和硅基寡核苷酸芯片，在硅基寡核苷酸芯片上设有锚定探 针；

所述盖玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方，盖玻片的面积大于(略大于即可)硅基 寡核苷酸芯片的面积；在盖玻片和硅基寡核苷酸芯片之间用于放置厚度为10～50um(例如 为45～55μm，即，厚度为50μm左右)的组织冷冻切片，所述组织冷冻切片的面积小于盖玻片 的面积；且组织冷冻切片的面积≤(即，略小于或等于)硅基寡核苷酸芯片上所有探针覆盖 的面积。

作为本发明的基于组织和芯片空间位置信息的空间转录组测序技术装置的改进： 所述硅基寡核苷酸芯片的锚定探针为5'-GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC ACC。

本发明还同时提供利用上述任意一种装置进行的空间转录组测序技术方法，包括 以下步骤：

1)、首先加入第一段引物(20nmol)，第一段引物的序列为5'-GTGACTGGAGTTCAGACG TGTGCTCTTCCGATCT，退火温度为75度/70度；

然后再加入第二段引物(约2ug的总量)，0.1μMPolyd(T)Primer5'PHO- GNNNNNNNCCT(13-18)VN，退火温度从70降到15度；

再加入T4连接酶(2ul)，用于连接第一段和第二段引物，维持温度15度，反应(快速 反应)20min，反应完成后吸走多余液体；

2)、将组织切片放置于盖玻片表面(加有位置标记的盖玻片表面)，组织切片的厚 度为10～50um(原则以小于或约等于细胞厚度为准)，大小不超过1.5×1.5cm；将样品朝上 的盖玻片放置于显微镜下观察组织细胞的位置，并拍照用于后续定位；

完成拍照后，在芯片表面加入裂解液(10ul)，从而使裂解液铺满探针芯片探针表 面；将盖玻片覆盖在芯片上，组织样品向下直接与芯片探针接触；

盖玻片大小与芯片探针部分的大小对应，用于对应定位组织的部位；

对芯片进行如下孵育，75℃---3min---65℃-0.1℃/s-(37～45)℃---取出；