[发明专利]一种双功能酸性脲酶结构基因及其表达和应用

说明书

本发明公开了一种酸性脲酶结构基因及其表达和应用。本发明是将来源于普罗维登斯菌JN‑B815(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326)的脲酶结构基因ureABC连接到大肠杆菌表达载体pET‑28a上，然后将重组质粒pET‑28a‑ureABC导入E.coli BL21(DE3)。用此重组菌能表达含有结构亚基的可溶性酸性脲酶。经镍柱纯化后，此脲酶体现出与原始菌中提取的酸性脲酶具有相同的性质，同时体现出脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活。

技术领域

本发明涉及一种酸性脲酶，特别是一种酸性双功能脲酶基因，属于生物工程技术领域。

背景技术

氨基甲酸乙酯(EC)是一种广泛存在于发酵食品和酒精饮料中，自然生成的具有致癌性的物质，由乙醇和尿素反应产生。由于氨基甲酸乙酯的致癌性，严格控制食品及酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量已经备受关注。

尿素作为产生氨基甲酸乙酯的前体物质，主要由发酵过程中精氨酸代谢产生。因此，从去除尿素的水平来控制酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量是一种比较可行的方案。目前，通过向酒精饮料中添加适量脲酶以酶解法的方式去除尿素被视作最具高效性和特异性的方法。

尽管有许多被认知的细菌脲酶和植物脲酶已经被广泛研究，但由于其最适pH均在中性或碱性，大多数脲酶在实际应用中均受到限制。并且，我国出口黄酒中所用脲酶均为日本进口，国际上关于氨基甲酸乙酯降解酶的报道也较少。因此，表达和生产一种酒用酸性脲酶(最适pH2-5，乙醇耐受性达10％-20％)用以提升我国酿酒业的品质以及拓展国际市场具有重要意义。

本发明中重组大肠杆菌所表达的可溶性脲酶，虽只具有脲酶的结构亚基，但体现出与原始菌产酸性脲酶具有相同的双功能酶性质，表现出能同时分解尿素及氨基甲酸乙酯的特性。这一特性使得酸性脲酶对于黄酒中EC含量的控制具有双重作用。进而能进一步降低黄酒中EC的含量，为将来此类双功能酶在黄酒中的应用奠定了基础。

发明内容

本发明的第一个目的提供一种新的双功能脲酶基因核苷酸序列如下所述：

1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)在SEQ ID NO.1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90％，且具有脲酶及氨基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。

含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本发明要求保护的范围。

所述普罗维登斯菌JN-B815由本实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326。

本发明的第二个目的是提供重组E.coli BL21(DE3)诱导表达可溶性脲酶的方法。

本发明的第五个目的是脲酶在黄酒中的应用。

本发明技术方案：一种胞内表达来源于普罗维登斯菌JN-B815酸性脲酶的重组E.coli BL21(DE3)的构建方法，是将来源于普罗维登斯菌JN-B815的酸性脲酶结构基因ureABC导入E.coli BL21(DE3)中得到基因工程菌。利用构建好的工程菌发酵制备含有结构亚基的可溶性脲酶，并对酸性脲酶进行纯化。

克隆方法可以采用化学合成法或PCR方法，本实验以PCR方法为例，但不限于PCR方法，具体步骤为：

(1)用酸性脲酶结构基因序列设计一对引物Fs、Rs，以普罗维登斯菌JN-B815基因组为模板扩增出目的基因ureABC：

Fs：CCGGAATTCATGCAATTAACCCCAAGGGAAATTGAA(EcoRⅠ)；