[发明专利]一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种可动态调节的荧光素酶分段融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；

其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；

所述活性阀门位于荧光素酶中间靠近N端位置；

所述活性阀门的氨基酸序列为IEGR；

所述荧光素酶为Gaussia荧光素酶或Renilla荧光素酶；

所述柔性肽段1和柔性肽段2分别独立为(GGGS)₄。

2.一种DNA片段，其特征在于，所述DNA片段编码如权利要求1所述的融合蛋白。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的DNA片段。

4.一种重组的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体。

5.一种如权利要求1所述的可动态调节的荧光素酶分段融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）选取插入位点，采用分段克隆，逐段构建包含荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白的重组载体；

（2）将重组载体转化到克隆菌种，筛选含有所述融合蛋白基因序列的阳性转化菌；

（3）从所述阳性转化菌中提取所述重组载体，并转化到表达菌中，得到含有所述融合蛋白的基因序列的阳性表达菌，对所述阳性表达菌扩大培养，诱导所述融合蛋白表达；

（4）融合蛋白的表达及纯化。

6.一种如权利要求1所述的可动态调节的荧光素酶分段融合蛋白在以非疾病诊断为目的的蛋白动态相互作用的模型的构建和检测中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测可用于核酸、蛋白、细菌、病毒或重金属离子的检测。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述模型的构建方法包括以下步骤：

（1’）将制备得到的荧光素酶分段融合蛋白与底物进行混合，用酶标仪检测体系中的生物发光强度；

（2’）向步骤（1）的体系中加入Factor Xa因子蛋白酶，孵育，再加入底物，混匀后通过酶标仪检测体系中的生物发光强度。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述底物的浓度为0.1-1μg/μL。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述底物的浓度为0.2-0.8μg/μL。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述底物的浓度为0.5μg/μL。

12.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述底物为肠腔素或荧光素的任意一种或两种的混合。