[发明专利]一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4‑8个疏水短肽氨基酸。通过短肽链氨基酸序列作为“活性阀门”并以特异性剪切酶作为“阀门钥匙”的活性调节方式，实现一种新型的荧光互补蛋白开关模式，可用于评估其他蛋白质动态相互作用如配体与底物的结合作用、能产生新结合位点的相互作用、使蛋白去活化的蛋白‑蛋白相互作用、改变蛋白作用底物特异性的蛋白‑蛋白相互作用。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白、其制备方法及应用。

背景技术

随着对亚细胞结构和功能、分子生理和病理、细胞间和细胞内信号通路研究的深入，人类对疾病和对生命本质的认识不断追朔到蛋白质、基因水平。而许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及内环境作用的反应等，均是以蛋白质间相互作用为纽带，通过调控、介导细胞的生物学活性，形成信号转导网络系统。因此，对蛋白质相互作用的深入研究是认识和理解各种生命现象的必要前提。

荧光素酶在有氧的条件下通过催化底物氧化而产生荧光，发射波长范围为400-600nm，峰值在450-500nm，且因其灵敏性高，特异性好，反应迅速，无生物性毒害等优势，可实时靶向基因分子事件、细胞生命活动、动物生理病理等生物学过程，是研究生物体内蛋白质动态相互作用的重要基础，目前被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等相关领域。

传统研究蛋白质相互作用的方法有酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等，但这些方法存在假阳性高，不能获得定量化信息，在实际的生理环境中需要破碎细胞造成机械损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时监测细胞内蛋白质相互作用等缺陷。现今最为常见的活细胞蛋白质相互作用模型有2种，一种是CFP和YFP等荧光蛋白质来实现的荧光共振能量转移(FRET)。这种技术由于荧光蛋白的量子产率低，供体与受体荧光光谱的差异小等问题，在实际开展中导致检测通道间相互干扰，高背景噪音等现象，要求非常苛刻的校准过程去除干扰降噪，这些都极大地限制了该技术进一步的发展和广泛的应用。另外一种是双分子荧光互补技术用于细胞体内蛋白质相互作用动态研究。CN 101620233 A公开了一种利用双分子荧光互补技术，基于橙红荧光蛋白和远红荧光蛋白，进行检测蛋白质之间的相互作用。但双荧光互补技术(BiFC)实时性较差，其要求两个片段在切开面能互补重新整合形成完整的荧光蛋白恢复荧光蛋白活性，此过程因组装分子荧光互补体系的不同而存在时间上的差异，几分钟甚至到几小时才能顺利检测到荧光互补信号，特别在活细胞体内这样一个复杂的环境，实际情况不得而知，仅仅通过光学信号强度改变来评估蛋白质相互作用在极大程度上可能存在偏差。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种可调节的荧光素酶分段融合蛋白，所述融合蛋白包括荧光素酶N端蛋白、柔性肽段1、MBP蛋白、活性阀门、柔性肽段2和荧光素酶C端蛋白；

其中，所述荧光素酶N端蛋白和荧光素酶C端蛋白共同组成荧光素酶；所述活性阀门为一段4-8个疏水短肽氨基酸。