[发明专利]一种β-羟丁酸的测定方法及其测定试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种β-羟丁酸的循环酶测定方法及 其测定试剂盒。

背景技术

酮体是甘油三酯的代谢产物。当体内的葡萄糖绝对或相对不足时，就会大量分解 体内的甘油三酯生成甘油和脂肪酸，脂肪酸在肝脏氧化生成能量和和酮体，该酮体包括2% 的丙酮、23%的乙酰乙酸和75%的β-羟丁酸，若体内酮体含量过高就会引起酮症酸中毒。酮中 毒是一种危险生命的疾病。及时、准确地检测酮体水平是预知酮症酸中毒的很需要手段。酮 体也是检测和控制糖尿病的重要标志物。

酮体和血糖一样，是检测代谢控制的一项重要的标记物。I型糖尿病病人的最重要 的特征之一就是易发展成为酮症酸中毒，这是由于胰岛素相对或绝对缺乏，葡萄糖的利用 障碍，机体就过度消耗脂肪，产生大量的酮体，造成酮症酸中毒，是一种威胁生命的疾病。Ⅱ 型糖尿病的后期，因胰岛素治疗无效，而过度消耗体内的甘油三酯，产生大量的酮体，形成 酮症酸中毒。另外，糖尿病的孕妇更易发生酮症酸中毒，是因为胎儿生长发育非常快，需要 大量的营养和能量，母体的高酮血症容易发生死胎，或影响胎儿神经系统的发育。因此及时 准确地检测酮体水平是十分关键的，是预知酮症酸中毒的重要手段。

上个世纪，我国在临床上普遍使用的是以硝普钠盐为基础的定性或半定量检测方 法。此方法只能检测丙酮和乙酰乙酸，但是这两者含量都很低，约占总酮体的话30%以下，最 大的问题是两者都不稳定，容易挥发和分解，因此，就造成了灵敏度低，重复性和特异性差， 容易出现假阳性或假阴性，造成误诊误治。另外，在酮症酸中毒的不同时期两者的浓度与病 情的发展不呈一致性。而β-羟丁酸就不同了，它占酮体的75%左右，含量比较高，化学性质稳 定，最主要是检测的浓度和病情的发展、恢复密切相关。

酶法测定β-羟丁酸具有灵敏度高、特异性好、快速简便等优点，成为临床检测常用 方法。酶法分为一步酶法和循环酶法。

《全国临床检验操作规程》（第四版），发明专利号为CN200610151020.4、CN 200610151021.9和CN99112967.9的专利所采用的是一步酶法：

在340nm处检测吸光度上升值，求出β-羟丁酸的量，该方法原理和试剂结构都简单，因 为β-羟丁酸的含量很低，所以反应灵敏度差，重复性差，误差比较大。

发明专利号为CN200910155638.1和CN1201110267888.1的专利采用的是循环酶 法：

在β-羟丁酸脱氢酶反应的基础上偶联黄递酶，使无色的氧化型硝基四氮唑蓝生成红色 的还原型硝基四氮唑蓝，在505nm处检测吸光度的变化，计算出β-羟丁酸的含量，反应过程 如下：

该反应循环进行，将产物进行放大，其灵敏度较一步法提高了10倍，线性范围也大幅提 高，但是增加了黄递酶和氧化型INT，使试剂成本很高，而且氧化型INT溶解度差，也不稳定。 目前，常采用三试剂法，操作步骤繁琐，稳定性仍不及动力学法，致使其在临床上的推广受 到限制。

发明专利号为CN201110267888.1的专利，在原有循环酶法基础上添加保护剂，所 提供的试剂盒稳定性得到提高。由于乳酸、抗环血酸对反应产生干扰，还需添加抗干扰剂， 试剂成本相对较高。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，旨在提供一种线性范围大、准确度和精密度高、 抗干扰性强、成本低、操作简便的β-羟丁酸测定方法和测定用液体试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明所采用方法为：样本中的β-羟丁酸被β-羟丁酸脱氢 酶和硫代氧化型辅酶Ⅰ（Thio-NAD⁺）特异性氧化，生成乙酰乙酸和硫代还原型辅酶Ⅰ（Thio- NADH）；乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶及还原型辅酶Ⅰ（NADH）存在下，又生成β-羟丁酸和氧化 型辅酶Ⅰ（NAD^＋），反应循环进行，产生大量的硫代还原型辅酶Ⅰ（Thio-NADH），通过405nm波长 下测定生成的Thio-NADH的吸光度变化来定量样本中的β-羟丁酸含量，其反应方程式如下：

该方法对样本中微量的β-羟丁酸起放大作用，β-羟丁酸的计算公式如下：

。

该试剂盒由以下组分构成：

β-羟丁酸脱氢酶1-100KU/L

缓冲液5-500mmol/L