[发明专利]胰岛素样肽

说明书

本发明专利申请是国际申请号为PCT/GR2010/000045，国际申请日为2010年10月8 日，进入中国国家阶段的申请号为“201080053472.3”，发明名称为“胰岛素样肽”的发明专 利申请的分案申请。

胰岛素样肽(INSL)，例如结构类似于胰岛素的这些肽，由2条肽链：A链和B链组成， 此2条链通过2个分子间二硫键连接在一起，同时A链含有一个额外的分子内二硫键。一个例 外是胰岛素样生长因子IGF-1和IGF-2，它们各由含70个氨基酸的一条肽链组成。

INSL家族除胰岛素外还包括INSL3、INSL4、INSL5、INSL6、松弛素1(RLN1)、松弛素2 (RLN2)和松弛素3(RLN3)以及生长因子IGF-1和IGF-2。

INSL肽显示具有重要的生物学性能，它们决定了代谢，例如胰岛素和IGF-1，并能 调节生物体的重要状态，例如妊娠受RLN1、RNL-2和INSL4调节。

胰岛素销售用于治疗糖尿病并可视为最佳的被研究蛋白质，IGF-1用于重度原发 性IGF-1缺陷病例治疗并在多项临床试验中针对适应征例如I型糖尿病、II型糖尿病、阿尔 茨海默症、严重烧伤和肌强直性肌营养不良症(MMD)等，RLN2在临床试验中测试了对急性心 力衰减、先兆子痫和硬皮病的效果，除此以外关于其他INSL及它们的衍生物和拮抗物的生 物学性能和可能的治疗应用知之甚少。

一种情况中表明由一种INSL的A链和另一种INSL的B链组成的嵌合肽能与相应 INSL的独特受体相互作用并显示显著的生物学活性。此外，已表明由IGF-1的A部分和IGF-2 的B部分组成肽链的IGF具有额外的重要生物学活性。对于大量的其它嵌合肽证明同样如 此。

尚未深入研究嵌合性INSL的生物学性能和可能的药学应用，因为它们的制备非常 困难。事实上只制备和研究了由INSL5的B链和其它INSL的各种A链组成的嵌合肽。特别是， 已发现由RLN3的A链和INSL5的B链组成的RLN3A/TNSL5与GPCR135和GPCR142受体相互作用。

对于由INSL的二条不同链组成的嵌合肽仅有限研究的原因是其合成的难度和低 产率。

迄今已采用的方法是A)随机混合直链A链与B链及其氧化，B)混合在半胱氨酸残基 的巯基处含磺酸基团的A链，和C)定点构建A链与B链之间的三个二硫键。认为此方法是迄今 为止制备INSL的最为改进的化学方法，虽然它需要多个步骤和5步层析纯化。显然所有上述 方法非但不尽人意而且导致制备少量INSL的难度大及成本高。此外，这些方法不适合大规 模生产。

由于化学合成困难，故采用重组DNA技术生产这些肽，例如胰岛素、松弛素和IGF。 但是重组DNA技术比常规的肽和蛋白质合成方法更为复杂。因此，即使在最简单的IGF-1的 情况中，还需要在分离得到其直链后选择性形成3个二硫键。

产生由2条肽链组成的INSL变得甚至更为困难，因为该情况中用重组DNA技术合它 们的前肽，如前胰岛素、前松弛素等前肽后，需要选择性形成二硫键并最后用酶去除各前肽 中间的C-肽段。

制备RLN2甚至更为复杂，在切除C肽段后需要额外的步骤通过加热将位于A链氨基 末端的谷氨酰胺残基转变为焦谷氨酸残基。因此，即使生物技术制备的INSL也很难制成，且 需要多步层析纯化才能获得药学上可接受纯度的INSL。这些巨大的困难和高生产成本导致 极大地延误了对许多INSL生物学性能的评价和在临床试验中对它们的药学应用测试，虽然 认为它们的生物学活性是肯定的。这对于含胰岛素链与其他INSL链结合的嵌合性INSL同样 成立。

发明内容

近年来我们发现并报道了一种随机重组RLN1和RLN2链的简单制备方法。该方法显 示很容易合成嵌合肽，例如由RNL2A/RLN1B所组成。用单环A链和双环A链时该合成方法特别 有效。这表明A链含有结构信息使其能与不对应链的天然对的胰岛素B肽链结合。

在本发明中，我们描述了胰岛素样肽A链的结构特征使它识别并选择性结合胰岛 素的所有B链和其它与那些肽相类似的链。肽链的结合总是选择性给出对应预期和天然胰 岛素样的结合。