[发明专利]利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法

权利要求书

1.利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、将不含外源基因的重组载体转入丝状真菌获得转化子Ⅰ；

步骤二、将所述转化子Ⅰ培养产孢，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和阴性对照组获得分析图Ⅰ和分析图Ⅱ，分析图Ⅰ中沿横坐标排布有孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ，根据分布在分析图Ⅰ右侧的孢子群Ⅱ的分布范围设定圈定门，在分析图Ⅱ中应用所述圈定门圈定孢子群Ⅲ；

步骤三、构建带有丝状真菌启动子、待测外源基因、荧光蛋白表达基因、和终止子的丝状真菌的转化子Ⅱ；以及

步骤四、重复步骤二，应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅱ获得分析图Ⅲ，应用所述圈定门在分析图Ⅲ中圈定范围，当落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量超过孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因成功表达，当落入圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子数量低于孢子群Ⅲ中孢子数量时，判定所述待测外源基因没有成功表达；

其中，所述转化子孢子Ⅰ为实验组，所述阴性对照组为带有空载体的丝状真菌孢子，所述丝状真菌的转化子Ⅱ为待检测组。

2.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；所述荧光蛋白位于所述启动子或外源基因的下游，位于所述终止子的上游，所述外源基因为脂酰辅酶A还原酶基因，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。

3.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述步骤二中圈定门的最小值为分析图Ⅰ中沿横坐标排布的孢子群Ⅰ和孢子群Ⅱ之间的接触处所对应的分析图Ⅰ中的横坐标值。

4.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述步骤二中应用流式细胞仪分析转化子孢子Ⅰ和丝状真菌孢子的具体方法为：设置流式细胞仪的样品压力为20000EPS，利用前向角散射光面积和宽度图，去除粘连和杂信号；荧光信号使用488nm激光激发，FL1通道分析。

5.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述转化子的构建方法具体为：

7.1)以丝状真菌的基因组DNA和含荧光蛋白表达基因的质粒为模板PCR扩增获得启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段；

7.2)将所述启动子基因片段、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段克隆入载体制备成质粒；以及

7.3)制备丝状真菌原生质体，应用所述质粒转化原生质体获得所述转化子。

6.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述启动子为翻译延伸因子1启动子和丙酮酸激酶启动子；所述终止子为内切葡聚糖苷酶I终止子和外切葡聚糖苷酶II终止子。

7.如权利要求5所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，所述步骤7.2)还包括：在重组酶的作用下，将PCR扩增得到的启动子、终止子片段和荧光蛋白表达基因片段组装成Ppki-gfp-Tcbh2、Ppki-hph-Tcbh2或Ptef1-gfp-Tegl1的结构克隆到pSIMPLE-19 EcoR V BAP载体上；以及将外源待测基因整合至上述载体gfp的上游位置。

8.如权利要求1所述的利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，其特征在于，将分析图Ⅲ中落入所述圈定门内的孢子群Ⅳ中孢子以单孔单孢的形式，分选到浅层黑色培养板中培养6天，酶标仪在入射光波长488nm，出射光波长530nm测定各转化子培养物的荧光值，其中，荧光值高于400的转化子培养物所对应的转化子为外源基因高表达的纯系转化子。