[发明专利]利用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法

说明书

本发明公开了一种重组载体，其包括启动子、外源基因、荧光蛋白和终止子，所述外源基因位于启动子的下游，位于终止子或荧光蛋白的上游；本发明还公开了重组载体在里氏木霉中表达目的蛋白及代谢途径构建中的应用。以及利用重组载体在丝状真菌中快速筛选外源基因的方法，以判定待测外源基因是否成功表达。该方法比传统的筛选方法大大缩短了筛选时间，提高了筛选的工作效率，同时，筛选过程中获得的可表达外源基因的转化子可通过复筛，获得高产量纯系转化子，以适应实际生产的需要；通过该方法还可以建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统，该系统可以有效加快丝状真菌的遗传改造进程，促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种应用重组载体在丝状真菌中筛选外源基因的方法。

背景技术

丝状真菌是一类由有隔菌丝组成的多细胞微生物，具有较强的蛋白分泌能力，可以产生丰富的次级代谢产物，因此在酶蛋白、药物、化工品等的工业生产中有着重要的应用(Verdoes et al.,1995；Wang et al.,2005)。

众多重要的丝状真菌菌株中，黑曲霉和里氏木霉在科学研究及工业生产中应用最为广泛，两者都是美国食品和药品管理局认证的GRAS(Generally Recognized as Safe)菌株，里氏木霉主要作为纤维素酶生产菌而受到重视，其野生型因纤维素的降解能力而被鉴定，经过多轮的诱变筛选，里氏木霉的胞外蛋白产量可以达到100g/L以上(Cherry andFidantsef,2003；Xu et al.,2009)，滤纸酶活力可以达到33FPU/ml以上，已经成为最主要的纤维素酶生产菌。

菌种改造是提升菌株生产性能的关键，基于基因工程的遗传改造是一种有效的菌种改造的措施(Meyer,2008)。虽然里氏木霉可以生产完整的纤维素降解酶系，但是胞外酶液中β-葡萄糖苷酶含量较低，Zhang等使用四个拷贝的cbh1启动子驱动bgl1基因在里氏木霉Rut C30中的过表达，将β-葡萄糖苷酶活性提高3.7倍，滤纸酶活提高130％，酶解玉米芯产生还原性糖的产量提高29％(Zhang et al.,2010)。

里氏木霉具有强大的木质纤维素降解能力，因此在联合生物加工(CBP)过程中有着重要的潜在应用(Singh et al.,1992；Xu et al.,2009)，CBP的目的是在菌株中构建高效的由木质纤维素向化学品(如乙醇、脂肪酸等)的一步转化途径，目前CBP的研究主要集中在对酵母的纤维素酶产生能力的改造，这主要是由于酵母乙醇产生能力较强，以及其基因工程的易操作性；但是纤维素酶系组分较多，有效的组合改造难度较大，因此改造纤维素降解菌的代谢路径，实现化学品的生产为我们提供了另一条CBP的思路。

构建及筛选性状优良的基因工程菌是一个系统工程，包括基因组水平改造(基于遗传转化的过表达或敲除基因)、改造后工程菌的筛选以及性状评价等(Moore,2007)。丝状真菌的遗传转化方法已经相对成熟，包括原生质体转化、农杆菌介导转化、电转化等，将DNA片段随机地插入到基因组中。但是由于其形态特点，丝状真菌的遗传改造过程相对模式微生物大肠杆菌、酿酒酵母等更加漫长，丝状真菌菌落为多核菌丝相互缠绕形成的菌团结构，不同于常规模式微生物的单一纯系菌落，为了在高假阳性背景的转化平板上获得纯系转化子，只能通过繁琐的单孢分离过程分离单核孢子，造成遗传改造周期过长；在此基础上的高表达量菌株的筛选则更加费时费力。

代谢通路的构建过程、菌种改造过程中通常需要外源基因的成功表达，但是外源基因产物会由于生物体严谨的控制系统而不能正常形成(Casselton and de la FuenteHerce,1989；Ngoepe,2011)，造成人力物力资源及时间的浪费，这种无效消耗在丝状真菌的遗传操作过程中更加严重。

因此建立一套检测外源基因表达以及高表达量纯系转化子的快速筛选系统，可以有效加快丝状真菌的遗传改造进程，促进构建丝状真菌细胞工厂的发展。

发明内容