[发明专利]一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法

权利要求书

1.一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)材料的准备与处理

材料选择花生品种J11，花生种子在Hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为26-28℃，生长14天用于后续的干旱胁迫处理；

干旱胁迫用PEG6000处理，花生根浸泡在20％PEG6000溶液中，在处理0h、6h、12h、18h、24h、48h和72h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用；

(b)RNA的提取和cDNA的合成

用TAKARA的MiniBESTUniversalRNAExtractionKit试剂盒方法分离提取花生幼苗RNA，将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA合成，用SMART-RACE试剂盒方法进行cDNA合成，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用；

(c)通过RACE进行克隆

RACE所用试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒，RACE扩增基因全长所用引物为GPS-AhAP2ERf-1:5’CGTTTACCCGTTGACTCCATTC-3’、GPS-AhAP2ERr-1:5’-TACCGACGCAAAGACGCAAGGTA-3’和NGPS-AhAP2ERr-1：5’-GTATAATCAGTCACTGGGAAG-3’；

RACE克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用UNIQ-10PCRPurificationKit试剂盒进行纯化，纯化产物连接pGEM-TEasy载体后转化至感受态E.coliTOP10，于LB培养基培养，随机挑取扩大培养，再进行PCR扩增检测并测序；

将测序的结果进行拼接后设计全长PCR扩增产物，用UNIQ-10PCRPurificationKit试剂盒纯化，纯化产物与pGEM-TEasy载体连接后转化至感受态E.coliTOP10中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR扩增预检测是否有插入片段并测序，扩增引物为AhAP2ER-S1：5’-AAACGCTCGCACACTG-3’和AhAP2ER-S2：5’-CATTTGTATTACCATGAGAATGC-3’。

2.根据权利要求1所述花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，其特征在于：全长PCR扩增所用聚合酶为TAKARAPCRMIX，其在20μL体系中加入以下成分：10μLTAKARAPCRMIX、1μL总cDNA、0.5μLAhAP2ER-S1、0.5μLAhAP2ER-S2和8μL无菌双蒸水；

全长PCR扩增反应条件：(a)94℃5min；(b)94℃1s；55℃1s；72℃2min；共30cycles；(c)72℃10min；(d)1％琼脂糖电泳检测。

3.根据权利要求1至2所述花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，所述的AhAP2ER基因开放阅读框为1266bp，共编码422个氨基酸。

4.根据权利要求1至3所述花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhAP2ER基因的氨基酸序列在NCBI网站上通过Blast分析后发现该基因氨基酸序列与大豆的AP2类蛋白At2g41710、菜豆AP2类蛋白001G131300g、绿豆AP2类蛋白At2g41710、苜蓿AP2类蛋白等同源性均达到了85％以上。

5.根据权利要求1至4所述花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhAP2ER基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE1。

6.根据权利要求1至5所述花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法，其特征在于：所述的AhAP2ER基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE2。