[发明专利]一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物基因工程领域，具体地说是一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法。

【背景技术】

我国是世界花生生产大国，总产量1500多万吨，占世界花生总产量的40％以上，居世界第一位。但是，花生产业的进一步发展受到旱灾的威胁。据统计我国每年因干旱引起的花生减产达30％～50％。除产量下降外，干旱还有可能导致花生黄曲霉毒素污染、品质下降等一系列后果。但由于花生品种资源遗传基础狭窄，缺乏相应基因源，利用传统育种方法难以培育出高抗品种。随着现代生物学的快速发展，近年来胁迫相关基因的研究取得了显著成果，同时利用转基因技术提高植物胁迫耐受能力的研究也取得了进步。当胁迫信号产生后，花生会启动一系列相应信号，最后传导到相关基因，启动该基因表达以协助花生适应或抵御逆境。转录因子是调控这些基因表达的重要因素。转录因子也称为反式作用因子，是指能够与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性作用的DNA结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的相互作用，调控基因的表达。转录因子已成为植物抗逆研究的一个重要研究方向。

AP2/EREBP家族都含有一个由58或59个氨基酸组成的DNA结合域,且这段序列高度保守，为髙等植物所特有的一类转录因子。根据其包含的DNA结合域与DNA结合类型分为5个亚族:DREB亚族、AP2亚族、RAV亚族、ERF亚族及AL079349。该类转录因子在植物生长及非生物胁迫抗性中均有重要功能。现已在拟南芥、大豆、豌豆、小麦中发现了该类基因。已有研究表明，几个AP2类基因参与了植物对干旱的响应(Liuetal.2013；Nakashimaetal.2009)。鲁燕等(2007)发现该类基因提高了转基因小麦的抗旱性；Oh等(2005)发现转基因水稻显著提高了抗旱性。大量研究表明在各种非生物胁迫过程中，AP2/EREBP家族蛋白的积累对植物在胁迫条件下起潜在的保护作用，但目前该类基困在花生中克隆和功能研究的报道较少，尤其是AP2亚族更少。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆及功能表达方法，显著提高花生的抗干旱能力。

本发明提供了一种花生干旱胁迫AhAP2ER基因的克隆方法，主要包括以下步骤：

(a)材料的准备与处理：材料选择花生品种J11，花生种子在Hoagland培养液培养萌发，萌发及幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为26-28℃，生长14天用于后续的干旱胁迫处理；

干旱胁迫用PEG6000处理，花生根浸泡在20％PEG6000溶液中，在处理0h、6h、12h、18h、24h、48h和72h时取花生的根作为材料，所有材料均保存于-80℃超低温冰箱中备用。

(b)RNA的提取和cDNA的合成

用TAKARA的MiniBESTUniversalRNAExtractionKit试剂盒方法分离提取花生幼苗RNA，将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA合成，用SMART-RACE试剂盒方法进行cDNA合成，之后将反转录产物于-20℃低温冰箱中保存备用，以上所用器皿都需经过去除RNA酶处理。器皿用0.1％的DEPC浸泡12小时，然后高压灭菌去除。溶液试剂用0.1％的DEPC处理(37℃放置12小时后高压消毒)，不耐高温的试剂直接用DEPC-H2O配制。

(c)通过RACE进行克隆，RACE所用试剂盒为Clontech的SMART-RACE试剂盒，RACE扩增基因全长所用引物为GPS-AhAP2ERf-1:5’CGTTTACCCGTTGACTCCATTC-3’、GPS-AhAP2ERr-1:5’-TACCGACGCAAAGACGCAAGGTA-3’和NGPS-AhAP2ERr-1：5’-GTATAATCAGTCACTGGGAAG-3’。

RACE克隆产物经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后用UNIQ-10PCRPurificationKit试剂盒(上海生工)回收纯化。纯化产物与pGEM-TEasy载体(北京全是金生化科技有限公司)连接后转化至感受态E.coliTOP10(北京全是金生化科技有限公司)中，LB培养基培养，随机挑取10个阳性克隆进行扩大培养，菌液PCR扩增预检测是否有插入片段并测序。