[发明专利]一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法

权利要求书

1.一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其特征在于：

(一)拟定量比较比活性的酶及其突变体合称目标酶；其中，所述酶为起始酶，其余突变体来自该起始酶的定点突变、随机单位点突变或随机多位点突变，且目标酶在原核或真核宿主细胞中能直接可溶性活性表达，或与增溶标签后融合后在原核宿主细胞中能可溶活性表达；

(二)通过如下的步骤，均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性：

(1)制备针对目标酶的多抗：选需要定量比较比活性的起始酶或某个突变体，重组表达后纯化到70％以上纯度作为免疫原；选体重在0.2kg以上哺乳动物，哺乳动物选自兔子、豚鼠和羊，用所选免疫原对该哺乳动物进行多次免疫；首次免疫用弗氏完全佐剂，此后用弗氏不完全佐剂，相邻两次免疫的间隔长于1周但短于4周，合计免疫3次以上；免疫次数达到要求后，收集被免疫哺乳动物的血清作为抗血清，用0.22μm滤膜过滤的滤液为所需多抗；

(2)重组表达目标酶：以可溶性活性表达为前提选择重组表达所需宿主细胞和表达载体；难以在原核宿主细胞中直接可溶活性表达的真核酶蛋白，用增溶标签在原核宿主细胞内进行融合表达；所有目标酶用相同宿主细胞和表达载体进行重组表达，优化条件使表达效率满足如下要求：

(a)如宿主细胞中没有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的百分含量即丰度不低于1％；

(b)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性可溶性内源性酶的20倍；

(c)如宿主细胞中有与目标酶催化活性相同的部分可溶性内源性酶，要求重组表达后在细胞内所有可溶性蛋白中，目标酶蛋白的丰度不低于相同催化活性内源性酶可溶部分的20倍；

(3)制备未纯化目标酶的样品：目标酶诱导表达后收集宿主细胞用超声处理、化学裂解或冻融裂解，将裂解液离心得上清液，再用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；

(4)建立免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量：以免疫原或其它某个目标酶为参考品；在总体积为0.050到3.0ml的中性的磷酸盐或Tris-HCl缓冲液中，将多抗与参考品混匀且参考品在反应体系最终浓度在1.0～30.0mg/L，并在混合后的反应体系加入分子量2,000到1,0000道尔顿的聚乙二醇达到30g/L以上；室温反应5.0到30min后测定310到410nm间某个波长的消光值及630到800nm间某个波长下的消光值，以前者消光值减去后者消光值为响应信号即纵坐标，以反应体系所含参考品最终浓度为横坐标作图得参考品的响应曲线；用参考品终浓度的一次或二次多项式拟合响应曲线，对应最好拟合函数为响应函数；以响应信号达到拟合响应曲线所得回归估计标准差三倍对应参考品最终浓度或响应信号为检测下限，与用响应函数预测的响应信号相差不超过回归估计标准差两倍的最大响应信号或其对应参考品最终浓度为定量上限；

(5)测定样品中目标酶活性：用目标酶的底物，常规测定未纯化目标酶样品中目标酶活性；用相同的活性单位定义，换算成样品中目标酶活性浓度；

(6)测定样品中目标酶蛋白量：用样品代替参考品与前述多抗反应，以免疫比浊法选择性测定样品中目标酶蛋白量；调整加样量，使所得响应信号比检测下限高30％以上而低于定量上限对应的响应信号；用响应函数换算成样品中的目标酶蛋白浓度；

(7)计算样品中目标酶比活性：据前述所测样品中目标酶活性浓度除以免疫比浊法选择性测定所得样品中的目标酶蛋白浓度，得到样品中的目标酶比活性；

(8)比较未纯化目标酶比活性：对目标酶比活性排序比较，或以起始酶或某个突变体为比较对象，将其余目标酶比活性除以比较对象的比活性得到相对比活性，再进行比较。

2.据权利要求1所述一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其适合高通量快速比较目标酶所构成库中各成分的比活性识别阳性突变体；其应用过程还有如下特征：

(一)所选裂解宿主细胞的操作过程，对目标酶活性影响小于10％；

(二)来自原核或真菌的目标酶，在原核宿主细胞中重组表达；

(三)来自高等真核细胞的目标酶，分子量小于30,000道尔顿时直接在原核宿主细胞中表达，如分子量更大则用增溶标签在原核宿主中融合重组表达，或用昆虫细胞重组表达；

(四)制备针对目标酶的多抗时，能对免疫原产生免疫反应的动物都可用；冻存后的多抗，临用前用中性磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液复溶，离心去沉淀，再用0.22μm滤膜过滤所得滤液就得到适合使用的多抗试剂；

(五)免疫比浊测定目标酶蛋白含量时缓冲液pH在6.0到8.0之间；适用的缓冲液选自磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷-HCl、HEPES和硼酸-硼砂、甘氨酸-氢氧化钠。