[发明专利]一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法

说明书

一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，涉及如下步骤：重组表达需比较比活性的起始酶及其突变体；超声、化学裂解或冻融裂解宿主细胞，离心上清液用0.22μm滤膜过滤后的滤液为样品；用纯化后起始酶或某个突变体为免疫原，免疫哺乳动物所得抗血清为多抗；用聚乙二醇促进免疫复合物形成，测定样品和多抗反应混合物在310到410nm间某波长下光密度与630到800nm间某波长下光密度之差为检测信号，用前述免疫原为参考品建立选择性测定样品中起始酶及其突变体蛋白量的免疫比浊法；用此免疫比浊法均相测定样品中起始酶或其突变体的蛋白量，据样品中酶活性换算成比活性用于排序或计算相对值进行比较。此方法效率高且不依赖于融合标签表达酶及其突变体。

技术领域

本发明属于酶生物技术领域，涉及酶比活性的测定和定量比较，适用于筛选酶突变体库、快速确认阳性突变体、快速测定比活性进行比较研究酶序列结构和活性关系。

背景技术

酶是重要的生物技术产品，其应用都需酶比活性尽可能高，否则应用成本很高甚至不能应用，如免疫分析标记酶比活性太低则因其灵敏度太低而不能用。为提高酶比活性需要进行酶分子工程，即通过合理设计改变酶蛋白的氨基酸序列，或者随机改变酶蛋白的氨基酸序列，在进行重组表达后测定比活性进行筛选实现定向进化。不论用哪种策略进行酶分子工程，或者研究酶的氨基酸序列和活性的关系，都需快速测定大量酶突变体的比活性进行定量比较。传统方法测定酶及其突变体比活性时需重组表达后逐个纯化再测定蛋白量和活性计算比活性，其效率低且成本高；对于难以纯化的酶及其突变体，其花费和时间更难承受。

通过receiver-operator-curve(ROC)分析考察用特定的酶活性指标定性识别阳性突变体的曲线下面积(area-under-curve，AUC)，是衡量识别可靠性的定量指标。测定诱导表达后细胞裂解液中酶活性很容易，但目标酶蛋白诱导表达丰度变异大，用于识别比活性提高1倍阳性突变体的AUC通常不超过0.82。测定细胞裂解液中总蛋白浓度计算表观比活性，用于识别比活性提高1倍阳性突变体的AUC也很难超过0.90。理论上，选择性测定细胞裂解液中目标酶的蛋白量或针对相同参考品的相对量计算出其(相对)比活性用于比较，只要测定活性和目标酶蛋白量的精度足够高，用于识别比活性提高1倍阳性突变体的AUC有望超过0.98。

免疫学方法能选择性测定混合物中特定蛋白含量。为低成本和高效率，需快速测定每个突变体数个单克隆的细胞裂解液中目标酶蛋白量计算比活性进行比较识别阳性突变体，这就要求精度高且效率高的均相免疫分析方法。免疫比浊法就属于均相分析方法，其用多抗作为试剂故成本低；所测信号对反应体系中目标酶的浓度接近线性响应，保障了数据换算的精度高。但免疫比浊法测定范围窄且灵敏度较低。优化诱导表达过程提高目标酶在细胞中表达丰度、调整加样量重新测定，有望用免疫比浊法测定细胞裂解液中目标酶蛋白量；用非线性响应曲线拟合计算目标酶蛋白量也能拓宽测量范围。酶蛋白多抗易于制备。所以，用免疫比浊法测定细胞裂解液中目标酶蛋白量，有望解决识别阳性突变体的问题且通用。

发明内容

1.一种均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性的方法，其特征在于：

(一)拟定量比较比活性的酶及其突变体合称目标酶；其中，所述酶为起始酶，其余突变体来自该起始酶的定点突变、随机单位点突变或随机多位点突变，且目标酶在原核或真核宿主细胞中能直接可溶性活性表达，或与增溶标签后融合后在原核能可溶性活性表达；

(二)通过如下的步骤，均相定量比较未纯化酶及其突变体比活性：

(1)制备针对目标酶的多抗：选需要定量比较比活性的起始酶或某个突变体，重组表达后纯化到70％以上纯度作为免疫原；选体重在0.2kg以上哺乳动物，包括但不限于兔子、豚鼠和羊，用所选免疫原对该哺乳动物进行多次免疫；首次免疫用弗氏完全佐剂，此后用弗氏不完全佐剂，相邻两次免疫的间隔长于1周天但短于4周，合计免疫3次以上；免疫次数达到要求后，收集被免疫哺乳动物的血清作为抗血清，用0.22μm滤膜过滤的滤液为所需多抗；