[发明专利]抗p185erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26、乳腺特异性表达载体、转基因FVB小鼠及其制备方法

权利要求书

1.一种抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26，主要由重链基因H和轻链基因L编码的氨基酸组成，其特征在于：所述重链基因H和轻链基因L分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列；所述抗体具体按以下操作制备：通过将SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列分别连接到乳腺特异性表达质粒pBC1上，构建得p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L，将pBC1-H和pBC1-L线性化后，导入FVB小鼠受精卵生产出转基因FVB小鼠，以其作为乳腺生物反应器，通过乳腺特异性表达而获得抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26；其中，乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L的构建方法为：

<1>以含有抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26重链基因H和轻链基因L的pUC57/pBCN-H-F2A-L-ployA-EGFP-Neo质粒为模板，在LA Taq DNA聚合酶作用下，分别以H-F/H-R和L-F/L-R为引物扩增出抗p185^{erb B2}人鼠嵌合抗体ChAb26重链基因H和轻链基因L；PCR反应的程序为94℃5min；94℃30sec；50℃30sec；69℃2min30sec；35cycles；69℃7min，4℃∞；其中，所述重链基因H和轻链基因L分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列；

<2>使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将步骤<1>扩增出的重链基因H和轻链基因L回收纯化；

<3>将步骤<2>回收的重链基因H和轻链基因L分别连接到pEASY-T1克隆载体上，获得重组子pEASY-T1-H和pEASY-T1-L；

<4>使用Xho I对步骤<3>获得的重组子pEASY-T1-H和pEASY-T1-L进行酶切并使用乙醇沉淀法将酶切产物重链基因H和轻链基因L进行回收纯化；

<5>将步骤<4>回收的重链基因H和轻链基因L分别与预先经Xho I酶切和CIP碱性磷酸酶去磷酸化的乳腺特异性表达质粒pBC1在T7连接酶作用下连接，构建得到抗p185^{erb B2}人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。

2.用于制备权利要求1所述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26的乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L的构建方法，其特征在于按以下操作进行：

<1>以含有抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26重链基因H和轻链基因L的pUC57/pBCN-H-F2A-L-ployA-EGFP-Neo质粒为模板，在LA Taq DNA聚合酶作用下，分别以H-F/H-R和L-F/L-R为引物扩增出抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体ChAb26重链基因H和轻链基因L；PCR反应的程序为94℃5min；94℃30sec；50℃30sec；69℃2min30sec；35cycles；69℃7min，4℃∞；其中，所述重链基因H和轻链基因L分别具有序列表SEQ.ID.No.3和SEQ.ID.No.6的碱基序列；

<2>使用琼脂糖凝胶回收试剂盒将步骤<1>扩增出的重链基因H和轻链基因L回收纯化；

<3>将步骤<2>回收的重链基因H和轻链基因L分别连接到pEASY-T1克隆载体上，获得重组子pEASY-T1-H和pEASY-T1-L；

<4>使用Xho I对步骤<3>获得的重组子pEASY-T1-H和pEASY-T1-L进行酶切并使用乙醇沉淀法将酶切产物重链基因H和轻链基因L进行回收纯化；

<5>将步骤<4>回收的重链基因H和轻链基因L分别与预先经Xho I酶切和CIP碱性磷酸酶去磷酸化的乳腺特异性表达质粒pBC1在T7连接酶作用下连接，构建得到抗p185^{erb B2}人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。