[发明专利]一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组表达人谷氨酸脱羧酶的毕赤酵母基因工程菌，属于基因工程领域。

背景技术

谷氨酸脱羧酶(glutamicaciddecarboxylase，GAD，EC4.1.1.15)在生物体内广泛存在，其催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid，GABA)，而GABA是哺乳动物体内一种重要的抑制性神经递质。在对自身免疫性疾病以及糖尿病研究中，特别是I型糖尿病，GAD、GABA以及谷氨酸脱羧酶抗体(glutamicaciddecarboxylaseantibody，GAD-Ab)，等的水平作为病理分析、疾病诊断、免疫治疗的重要参数，历来备受研究者关注。

GAD存在两种异构体形式：分子量为65,000的GAD₆₅和分子量为67,000的GAD₆₇，两者分别由不同染色体上的非等位基因编码。GAD₆₅基因位于第10染色体短臂(p)11.23区段，GAD₆₇基因位于第2染色体长臂(q)31区段。它们的氨基酸同源性占60-70％，主要区别在1-95和325-355位氨基酸序列。70-90％的Ⅰ型糖尿病患者血清中可检测出GAD₆₅抗体，15-25％的Ⅰ型糖尿病患者有GAD₆₇抗体，说明Ⅰ型糖尿病患者体内GAD自身抗体主要是针对GAD₆₅抗原的。

随着人们生活方式及饮食结构的改变，糖尿病在我国有着越来越高的发病率。减少糖尿病并发症成为一个棘手的问题。目前越来越多的人把目光转移到了利用基因工程手段获取GAD抗原。此种方法不仅原料消耗小，成本低，纯度高，且克服了由于GAD₆₅蛋白在胰腺组织中含量极低，制备困难，以及人源组织不易获得等缺点，因而具有广泛的临床应用前景。

目前，虽然已有少数报道将哺乳动物来源的GAD₆₅成功表达于微生物中，但存在表达量低、质粒表达量不稳定、酶活低、形成包涵体、胞内分泌等问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组表达人谷氨酸脱羧酶(GAD)的毕赤酵母基因工程菌，实现了人谷氨酸脱羧酶的活性表达、高效表达。本发明采用毕赤酵母为宿主和基因组整合性质粒pPICZα为表达载体，成功的把人源GAD₆₅基因重组到毕赤酵母基因组上且形成产物分泌到胞外，这不仅克服了质粒表达的不稳定性、表达量低等问题，而且也简化了形成包涵体或胞内分泌所带来的工作量。所筛选得到重组菌株，经甲醇诱导能过量表达GAD₆₅并分泌到胞外，其具有免疫原性。

本发明提供了一种高效活性表达人的谷氨酸脱羧酶的方法，是构建以毕赤酵母为宿主整合表达核苷酸序列如SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶的重组菌，然后以该重组菌发酵生产人的谷氨酸脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶基因GAD₆₅连接到表达载体pPICZα上，得到重组质粒pPICZα-hGAD₆₅，然后电转入毕赤酵母X-33菌株，使GAD₆₅全编码序列插入酵母基因组中，筛选得到重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将重组菌活化后接种于BMGY培养基培养20h，然后静置弃上清，用BMMY培养基重悬菌体并加入甲醇诱导培养。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵具体是：将重组菌单菌落接种于生长培养基BMGY中，30℃，200r/min培养20h；将菌液，室温静置1h，弃掉上清液，用30mLBMMY培养基重新悬浮菌体，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)，30℃，200r/min培养，每隔24h补加100％甲醇至终浓度为1％(v/v)进行诱导；诱导48h后，12000r/min离心5min，保留上清液，即为含有谷氨酸脱羧酶的液体。

本发明还提供一种毕赤酵母基因工程菌，所述基因工程菌以毕赤酵母为宿主表达核苷酸序列如SEQIDNO:1所述的谷氨酸脱羧酶。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主是毕赤酵母X-33菌株。