[发明专利]EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及果树诱变育种技术领域，尤其是一种EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法。

背景技术

火龙果为仙人掌科多年生攀援性肉茎植物，原产中美洲，是热带、亚热带的名优水果之一。火龙果抗寒力较差，即使在热量丰富的亚热带地区栽培也可能受低温冻害的影响，如2007年底至2008年初的低温凝冻天气、2013年12月的低温冷害及2014年2月的倒春寒天气，造成广西、贵州、云南等南亚热带地区大面积火龙果园受冻严重。有研究表明，当温度低于5℃时将可能导致火果受冻，其幼芽、嫩枝，甚至包括部分成熟枝条也会被冻伤或冻死。温度越低，持续时间越长，对后期火龙果产量和品质的影响越严重，0℃是大多数栽培品种能忍受的最小阈值。但目前生产上耐低温的火龙果资源相当缺乏，且受区域的限制，国内外有关火龙果抗寒及育种等方面的研究相当少见。

EMS诱变技术是现代分子育种及资源创新的一种行之有效的方法之一。特别是诱变剂与组织培养技术相结合，可提高细胞有益突变率10-100倍。而诱变材料的选择园艺植物诱变育种成败的关键之一。在离体化学诱变中，茎尖、叶片、愈伤组织等均可作为诱变材料使用，但必须保证诱变剂的有效渗入和诱变后材料能进一步生长、发育，最终产生新的个体。因此，提高诱变频率和减少外植体的损伤是化学诱变处理中的一个矛盾，如何确定诱变剂浓度和处理时间因材料不同而异，即使同一材料的不同形态采用EMS诱变效果也存在较大差异。

发明内容

本发明的目的是：提供一种EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，它成功率高，所获得的火龙果无菌幼苗具有较强的抗寒能力。

本发明是这样实现的：EMS离体诱变提高火龙果抗寒性的方法，包括如下步骤：

1）以从火龙果成熟茎段上培育的单个无菌苗为试材，将试材浸泡在体积浓度为3.71-3.95%的EMS处理液中，使试材与EMS处理液完全接触，处理期间经常摇动，使溶液与无菌苗均匀接触，处理时间为8.26-9.32小时；

2）在步骤1）的处理时间完毕后，用无菌水冲洗5次以上，去除毒性，吸干表面水份，将单株苗接种于继代培养基上恢复生长25-35d，促进其生长分化；

3）在步骤2）中将恢复生长后分化出的不定芽进行HYP逐步筛选，在最大耐受浓度为20mmol/L的HYP的培养基中培养筛选12-18d后，存活的芽继续接入含有20mmol/L的HYP的选择培养基中培养18-25d；再将存活的材料转入不含HYP的培养基中培养18-25d；

4）在步骤3）中最后存活的材料在0-4℃下进行低温诱导7-24d，从而增强火龙果的抗寒性。

所述的HYP筛选采用多步筛选法，将EMS诱变处理后新增殖的不定芽依次转入含不同浓度的HYP选择培养基上培养15d，以未经EMS处理的芽作为对照；筛选出火龙果对HYP的最大耐受浓度20mmol/L，即为选择压。

步骤2）中的继代培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.05%+CCC0.5mg/L。

步骤3）中采用筛选培养基均为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+AC0.05%+CCC0.5mg/L+HYP20mmol/L；步骤3）中不含HYP的培养基即为步骤2）中的继代培养基。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明以从火龙果成熟枝条上诱导的无菌幼苗为试材，通过EMS诱变处理，对成活的幼苗施加HYP选择压，通过选择压能够成活的幼苗再经低温诱导，获得的火龙果无菌幼苗具有良好的抗寒能力。这样的方法不仅有利于保存母本的优良性状和后代的遗传稳定性。同时采用离体诱导，操作条件可控，突变率相对较高，为火龙果的抗寒新品种选育及寻找提高抗寒性的新途径提供重要的理论依据和参考。本发明简单易行，成本低廉，使用效果好。

附图说明,

图1为0℃持续低温处理下REC的变化情况；

图1中，E5代表3.8%EMS，H6代表20mmol/LHYP，下同；

图2为0℃持续低温处理下MDA含量的变化情况；

图3为0℃持续低温处理下Pro含量变化情况；

图4为0℃持续低温处理下SOD酶活性变化情况；

图5为4℃持续低温处理下REC的变化情况；