[发明专利]一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养方法

权利要求书

1.一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养 方法，以癌症患者的脐血或自体外周血为处理对象，其特征为， 包括如下步骤：(1)从脐血或自体外周血中分离出单个核细胞， 重悬于X-VIVO15培养基中静置培养；(2)将培养单个核细胞的培 养瓶晃动，分离贴壁细胞和未贴壁细胞，将贴壁细胞诱导为未成 熟DC细胞；(3)将未成熟DC细胞通过iAPA腺病毒因子转染并诱 导为成熟DC细胞；(4)将成熟DC细胞和T细胞混合共培养，连 续刺激得到CTL细胞；(5)将经DC细胞激活的CTL细胞进行增殖 培养。

2.根据权利要求1所述的经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞的培养方法，其特征为，步骤(1)的主要操作为：①将 采血袋经酒精浸润的无尘纸擦拭洁净后放入生物安全柜，利用 50ml注射器抽取血袋中的血液分装到50ml离心管中，每管血液 30ml，经2000rpm下离心10min；②离心后，将上层血浆置于一支 新的50ml离心管中。吸至距分界面0.5cm处为止，若剩余血细胞 多于15ml，则取上层15ml血细胞置于新的离心管中，弃去底部剩 余红细胞；③用生理盐水按照1∶1的比例稀释白细胞，取装有15ml ficoll的离心管并倾斜，缓慢的将混匀的血细胞加到ficoll液面 上，使其呈清晰的界面，血样与ficoll的比例不超过2∶1，于常 温1600rpm下离心20min；④离心后液面将分为4层，从底部分别 为红细胞、ficoll层、白膜层和上清液层，吸弃上清液层，缓慢 吸取白膜层细胞至新的50ml离心管中，加生理盐水至45ml，混匀， 1500rpm下离心10min；⑤离心后弃上清，细胞沉淀先用5ml生理 盐水重悬，再加生理盐水至45ml，混匀，取样用于计算细胞数量， 1300rpm下离心10min；⑥离心后弃上清，用X-VIVO15培养基将 细胞密度调整为10⁷/ml。

3.根据权利要求1所述的经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞的培养方法，其特征为，步骤的(2)的主要操作为：① 将细胞密度为10⁷/ml的脐带血单个核细胞按照10⁶/cm²的细胞数量 加入到培养瓶中，37℃、7.5％CO₂浓度培养箱中培养；②静置培养 2h后，轻轻晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸走上层未贴壁细 胞至于新的培养瓶中，加入含GMCSF1000U/ml、IL-41000U/ml 的X-VIVO15培养基，于37℃、7.5％CO₂浓度培养箱中培养；③第 二天晃动培养瓶，将未贴壁细胞晃起，吸弃培养液，重新补入含 GMCSF1000U/ml、IL-41000U/ml的X-VIVO15培养基继续培养； ④每隔两天半量换液，加入含GMCSF1000U/ml、IL-41000U/ml 的X-VIVO15培养基，第5天完成未成熟DC细胞的培养，收集细 胞，取样进行流式检测细胞表型。

4.根据权利要求1所述的经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞的培养方法，其特征为，步骤(3)的主要操作为：①收 集培养至第5天的未成熟DC细胞，取样计数，计算DC的总量， 1500rpm，离心10min；②离心后弃上清，加入含1000U/mlGMCSF、 1000U/mlIL-4和100ng/mlTNF-α的X-VIVO15培养基重悬细胞， 将细胞密度调整为5×10⁶/ml，按照MOI为10⁴vp/cell的病毒用量 加入细胞悬液，充分混匀，铺于培养瓶中，37℃、7.5％CO₂浓度培 养箱中培养；③培养48h后，收集悬浮细胞，将未悬浮细胞用细 胞刮刀刮起，混匀两种细胞为成熟DC细胞，取样计数，进行流式 检测细胞表型；④根据T细胞量确定DC需求量，将剩余的成熟DC 重悬于含10％DMSO的FBS中，程序降温法进行冻存。