[发明专利]一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种淋巴细胞的培养方法，特别涉及一种经腺病毒基 因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养方法。

(二)背景技术

免疫细胞治疗是治疗癌症的新的一种治疗手段，2008年，美国贝 勒医学院提出DC疫苗组合专利申请：沉默免疫负调控基因技术 (inhibitionofAntigenPresentationAttenuators，iAPA)俗称 “癌怕”技术，就是利用小干扰核糖核酸(siRNA)特异性阻断DC细 胞中关键的负调节因子SOCS1基因，使其基因表达沉默，诱导机体突 破自身对肿瘤的免疫耐受，增强抗原特异性免疫反应，进而提高肿瘤 免疫治疗的临床疗效。与传统的DC-CIK细胞相比，iAPA技术能够阻 止DC细胞进入免疫耐受状态，促进CTL特异性免疫活性的获得。而 且，iAPA腺病毒载体中含有癌细胞高效表达的肿瘤抗原基因Survivin 和MUC1，Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员，具有肿瘤特异性，只 表达于肿瘤和胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相 关；MUC1在多种肿瘤中异常表达，主要表现为：①表达量增高，可达 正常时的100倍以上；②细胞表面分布的改变，极性分布丧失，整个 细胞表面均表达；③结构改变，主要由于糖基化不全，出现新的糖链 及肽表位。主要组织相容性复合体MHC将肿瘤抗原蛋白呈递在DC表 面，激活肿瘤抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞，增强CTL抗癌靶向 性；鞭毛蛋白基因可以可操作地连接至信号前导序列，用于分泌，并 随后以自分泌和旁分泌的方式结合到DCs上的表面TLR5(Toll-like receptor5)，激活DC细胞病原菌识别能力。

沉默免疫负调控基因(iAPA)技术是一种新型的肿瘤免疫细胞治 疗技术。研究发现，经沉默免疫负调控技术处理的树突状细胞联同细 胞毒性T淋巴细胞(iAPA-DC/CTL)经瘤体局部和静脉注射后，可有 效抑制人肝癌细胞系HepG2细胞小鼠皮下移植瘤的生长。瘤体局部注 射的iAPA-DC可有效呈递肿瘤抗原，并趋向引导经尾静脉注射的CTL 向瘤体组织的迁移，产生杀灭肿瘤细胞，抑制肿瘤的生长与迁移的作 用。

统观现有技术不难发现，现有技术存在很多不足之处：现有免疫 细胞治疗中应用的免疫细胞主要包括CIK、NK、TIL、DC-CIK，是免疫 细胞的一类，但是其抗原特异性低，对肿瘤细胞的靶向性低； iAPA-DC/CTL技术具有一定的抗原特异性，但是CTL单纯在体外增殖， 不具有肿瘤抗原特异性；而且，受血液成分单采机的限制，不是每个 医院都能够实现单个核细胞的采集，产生局限性；肿瘤病人自体免疫 较弱，一次性抽取大量免疫细胞可能会对患者造成更坏的影响。

(三)发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种步骤简单、操作稳 定、对患者无伤害的经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴 细胞的培养方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

一种经腺病毒基因修饰的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的培养 方法，以癌症患者的脐血或自体外周血为处理对象，包括如下步骤：

(1)从脐血或自体外周血中分离出单个核细胞，重悬于X-VIVO15 培养基中静置培养；

(2)将培养单个核细胞的培养瓶晃动，分离贴壁细胞和未贴壁 细胞，将贴壁细胞诱导为未成熟DC细胞；

(3)将未成熟DC细胞通过iAPA腺病毒因子转染并诱导为成熟 DC细胞；

(4)将成熟DC细胞和T细胞混合共培养，连续刺激得到CTL细 胞；

(5)将经DC细胞激活的CTL细胞进行增殖培养。

本发明在现有细胞治疗细胞培养模式的基础上，发明了一种具有 肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞细胞(命名为iAPA-DC-CTL细胞) 培养方法。取150-200mL脐血或自体外周血进行单个核细胞分离， 贴壁2h分离培养DC细胞，未贴壁细胞于含IL-2的培养基中进行T 淋巴细胞预养。DC细胞经iAPA因子腺病毒感染诱导成熟后，收集成 熟DC，按照DC∶T为1∶10的效靶比刺激自体原初T淋巴细胞，使其分 化为细胞毒性T淋巴细胞，观察记录CTL的增殖能力、检测CTL的细 胞毒性。

本发明的更优技术方案为：

步骤(1)的主要操作为：