[发明专利]一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗及其制备方法

说明书

本发明公开了一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。本发明鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗由病毒液与耐热保护剂混合冻干而成；其耐热保护剂组方包括：蔗糖8～10%、聚乙烯吡咯烷酮2～4%、聚赖氨酸3～6%、酶解明胶1～2%、乳蛋白水解物2～6%、谷氨酰胺0.4～1%、L－精氨酸0.05～0.5%、甘油1～4%、芦布若尔2～5%；本发明通过胰酶冷消化、接毒后添加辅助液提高生产效率、降低成本；通过添加耐热保护剂，降低了病毒在冷冻和真空干燥过程中损伤，提高了产品在保存和使用中的稳定性；本发明方法制备的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗，实现了储运过程中冷藏保存，保存期延长到2～8℃保存36个月。

技术领域

本发明涉及一种耐热保护剂活疫苗及其制备方法，尤其是一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

马立克氏病是鸡的一种淋巴组织增生性肿瘤病，目前是危害养鸡业健康发展的三大主要疫病(马立克氏病、鸡新城疫及鸡传染性法氏囊病)之一，感染的鸡群出现较高的发病率和死亡率，成为一种世界性疾病。其病理表现为外周神经淋巴样细胞浸润和增大，引起肢(翅)麻痹，并在性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤等部位出现肿瘤样的病灶。

疫苗免疫是防控该病的重要手段。国内常用的弱毒疫苗有两种：一种为病毒与细胞结合的马立克氏病液氮苗，它的需用液氮保存，运输及保存条件苛刻使疫苗的长期保存和运输受到限制；另一种为病毒脱离细胞的火鸡疱疹病毒冻干活疫苗(HVT)，保存相对较易，使用广泛。

目前，马立克氏病火鸡疱疹弱毒疫苗采用鸡胚成纤维细胞生产，大多制成冻干活疫苗。现有的冻干疫苗生产工艺存在着生产成本较高、保存困难和免疫效果不尽理想等问题。因此，研发一种生产成本相对较低、适于大规模生产、保护功能强的马立克氏病活疫苗耐热冻干保护技术显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服已有技术之缺陷，提供一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗及其制备方法，制备的鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗具有耐热性能好、保护功能强的特点。

本发明的目的通过以下技术方案实现的：

一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗，是由鸡马立克氏病病毒与耐热保护剂混合冻干而成；所述耐热保护剂是由以质量体积百分含量计的下列组分构成：蔗糖8～10％，聚乙烯吡咯烷酮2～4％，聚赖氨酸3～6％，酶解明胶1～2％，乳蛋白水解物2～6％，谷氨酰胺0.4～1％，L－精氨酸0.05～0.5％，甘油1～4％，芦布若尔2～5％，余量为水。

一种鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

a.细胞制备：用EDTA-胰酶消化SPF鸡胚成纤维细胞，并加入细胞生长液，在36～37℃温度下培养20～28小时，至生成细胞单层；所述EDTA-胰酶的浓度为质量体积百分含量为1％～3％。

b.接毒：接种鸡马立克氏病病毒，加入细胞培养液体积10％的辅助培养液，按100～200万个/毫升复种鸡胚成纤维细胞，36～37℃继续培养2～4日。

c.收获与冻干：细胞病变达75％～85％时，弃去90％细胞培养液，转动细胞培养瓶，使细胞全部脱离瓶壁，收集、低速离心，取沉淀细胞并称重，加入耐热保护剂，进行匀浆和超声波裂解，定量分装和冷冻真空干燥，制成鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗。

上述鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，步骤a中EDTA-胰酶的消化温度为2～8℃，消化时间为10～18小时。

上述鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，步骤b中辅助培养液为含有水解乳蛋白、精氨酸和谷氨酰胺的水溶液。

上述鸡马立克氏病耐热保护剂活疫苗的制备方法，步骤c中耐热保护剂的加入量为每克沉淀细胞加入100～300ml。

本发明所述疫苗及其制备方法具有以下特点：