[发明专利]食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法和应用

权利要求书

1.食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，通过以下步骤构建得到：

S1将食管癌细胞株放置在36-38℃、4-6%CO₂、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养；

S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养 液，所述顺铂的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2ml 胰蛋白酶-EDTA消化液，接着以l×10⁵/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38℃、4-6%CO₂、 湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换 新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株；

S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺铂的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.6μg/ml顺铂的培 养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。

2.如权利要求1所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，通过以下步骤构建得 到：

S1将食管癌细胞株放置在37℃、5%CO₂、湿度为96%条件下的培养箱中培养；

S2将对数生长期的食管癌细胞培养至75%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液， 所述顺铂的作用浓度为0.03μg/ml，培养1小时后弃去含药培养液，加入1.5ml胰蛋白酶- EDTA消化液，接着以l×10⁵/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在37℃、5%CO₂、湿度为96%的条 件下培养，待细胞长至75%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺 铂的作用浓度不变，培养8周后，得稳定生长、传代的细胞株；

S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺铂的作用浓度培养5周，培养7个月，得在作用浓度为0.5μg/ml顺铂的培养体系中 稳定生长、传代的细胞株，即得。

3.如权利要求1或2所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，所述步骤S1的食管 癌细胞为食管癌细胞Eca-109或食管癌细胞EC-9706；所述食管癌细胞Eca-109的培养液为 含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液；所述食管癌细胞EC-9706的培养液为含10%胎牛血清的 DMEM培养液。

4.如权利要求1所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，所述步骤S3中适当增加 顺铂的作用浓度是采用0.02-0.04μg/ml、0.05-0.07μg/ml、0.12-0.13μg/ml、0.2-0.3μg/ml 和0.4-0.6μg/ml5个浓度梯度。

5.如权利要求3所述的食管癌顺铂耐药性细胞株，其特征在于，所述食管癌细胞Eca- 109细胞株对顺铂的耐药倍数为11.46倍；所述食管癌细胞EC-9706细胞株对顺铂的耐药倍 数为11.15倍。