[发明专利]食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及食管癌顺铂耐药性细胞株及其构建方法 和应用。

背景技术

食管癌是一种常见的食道恶性肿瘤，其中食管腺癌和食管鳞癌是最常见的食管 癌，食管腺癌主要发生在食管下部和食管与胃连接的部位，而食管鳞癌主要发生于食管的 上部和食管的中部。我国的食管癌患者大多为食管鳞状细胞癌（Esophagealsquamous cellcarcinoma，ESCC），占了食管癌患者的90%以上，而在西方国家，食管腺癌的发病率较 高。无论是食管腺癌还是食管鳞癌，其早期一般无发病症状，直到晚期病症才会凸显，因此， 人们很容易忽略早期食管腺癌和食管鳞癌的存在，待发现时已经错过了治疗食管癌的最佳 时机。

临床上用于治疗食管癌的主要方式有：手术治疗、化疗治疗、放疗治疗和药物治 疗。手术切除后辅助化学疗法是早期食管癌患者的主要治疗方式，但是上述方法对末期食 管癌患者治疗效果不理想，而且副作用大。目前，临床上主要采用药物治疗食管癌，主要治 疗食管癌的药物有：顺铂、五氟尿嘧啶、紫杉醇等，但是上述药物在治疗食管癌的过程中存 在选择性差，易出现耐药性的缺点。因此，研究食管癌耐药机制并且有效预防或逆转食管癌 耐药现象是目前亟需解决的难题。

近年来，肿瘤耐药细胞株已成为肿瘤细胞耐药机制研究、开发新型抗肿瘤药物及 评价新的肿瘤治疗方法的重要工具。目前，国内外已经建立了很多肿瘤的耐药细胞株。中国 专利申请201410161660.8公开了一种肝细胞癌索拉菲尼耐药细胞株及其构建方法，中国专 利申请201410183516.4公开了一种表柔比星诱导建立的乳腺癌多药耐药性细胞株及其构 建方法和应用，中国专利申请201510187748.1公开了曲妥珠单抗耐药的人乳腺癌细胞株及 其制备方法和应用。但目前尚无食管癌对顺铂的耐药细胞株。因此，建立食管癌对顺铂的耐 药细胞株具有重要的临床价值。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的之一在于提供食管癌顺铂耐药性的细 胞株。

本发明提供了食管癌顺铂耐药性细胞株，通过以下步骤构建得到：

S1将食管癌细胞株放置在36-38℃、4-6%CO₂、湿度为95-98%条件下的培养箱中培养；

S2将对数生长期的食管癌细胞培养至70-80%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养 液，所述顺铂的作用浓度为0.02-0.04μg/ml，培养1-2小时后弃去含药培养液，加入1-2ml 胰蛋白酶-EDTA消化液，接着以l×10⁵/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在36-38℃、4-6%CO₂、 湿度为95-98%的条件下培养，待细胞长至70-80%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换 新鲜的培养液，维持顺铂的作用浓度不变，培养6-8周后，得稳定生长、传代的细胞株；

S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺铂的作用浓度培养4-5周，培养5-7个月，得在作用浓度为0.4-0.6μg/ml顺铂的培 养体系中稳定生长、传代的细胞株，即得。

进一步地，所述的食管癌顺铂耐药性细胞株通过以下步骤构建得到：

S1将食管癌细胞株放置在37℃、5%CO₂、湿度为96%条件下的培养箱中培养；

S2将对数生长期的食管癌细胞培养至75%贴壁率时，弃去上清，加入含顺铂的培养液， 所述顺铂的作用浓度为0.03μg/ml，培养1小时后弃去含药培养液，加入1.5ml胰蛋白酶- EDTA消化液，接着以l×10⁵/ml细胞浓度接种于新培养瓶中，在37℃、5%CO₂、湿度为96%的条 件下培养，待细胞长至75%贴壁率时再次加入顺铂处理，24小时后换新鲜的培养液，维持顺 铂的作用浓度不变，培养8周后，得稳定生长、传代的细胞株；

S3在步骤S2得到的食管癌细胞中依次增加顺铂的作用浓度，重复步骤S2的操作，每增 加一次顺铂的作用浓度培养5周，培养7个月，得在作用浓度为0.5μg/ml顺铂的培养体系中 稳定生长、传代的细胞株，即得。