[发明专利]一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途

权利要求书

1.一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途，其特征在于，步骤为：

(一)oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达

(1)qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量

设计β-actin、TF、LOX-1三对引物，三对引物分别为：

β-actin上下游引物如下：

上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，

下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；

TF上下游引物如下：

上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，

下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；

LOX-1上下游引物如下：

上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，

下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′，

以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况，数据显示10μg/mLoxLDL作用于 J774A.1细胞4小时，LOX-1和TF的mRNA表达上调，P<0.05；

(2)Western-Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX-1和TF量

10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX-1和TF的蛋白表达上调，P<0.05；

(3)基因沉默上述小鼠巨噬细胞LOX-1后，经oxLDL刺激，该细胞表达TF量下调

与scrambledsiRNA相比，LOX-1siRNA沉默的J774A.1，TF的蛋白表达量下调，以上 说明oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控；

(二)beta2-糖蛋白第五结构域β2-GPIDV干预J774A.1细胞oxLDL上调LOX-1和TF蛋白 表达

22μg/mL、44μg/mL、88μg/mL、176μg/mL的β2-GPIDV分别和10μg/mL的oxLDL共同 刺激J774A.1细胞，与10μg/mL的oxLDL单独处理J774A.1细胞相比，LOX-1和TF蛋白表 达量下调，且重组β2-GPIDV浓度越大，抑制率越高，表明重组β2-GPIDV浓度依赖性的抑 制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达；

(三)建立表达人LOX-1基因的293T细胞模型，并检测其表达定位及生物学功能

设计一对上下游引物，如下：

上游引物：5′-CTAGCTAGCATGACTTTTGATGACCTAAAG-3′

下游引物：5′-TTGGAATTCTCACTGTGCTCTTAGGTTTGC-3′

其中，上游引物中5′端含有保护碱基、NheI酶切位点(单划线)以及LOX-1的5′端部 分氨基酸编码基因序列；下游引物中5′端含有保护碱基、EcoRI酶切位点(单划线)、LOX-1 的3′端部分氨基酸编码基因的互补序列以及终止密码子；

将引物以LOX-1片段为模板通过PCR扩增获得LOX-1基因片段，并克隆到表达载体 pIRES2-AcGFP1-Nuc上，构建表达质粒pIRES2-LOX-1，并转染至293T细胞，倒置荧光显微 镜检测质粒转染效率，RT-PCR和WesternBlot鉴定外源基因的表达，激光共聚焦检测外源基 因表达定位及其功能，结果表明，LOX-1基因在293T细胞中得到表达，并且定位在细胞膜 上，具有结合oxLDL的生物学活性；

(四)β2-GPIDV抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达的分子机理

利用上述建立的表达LOX-1的293T细胞模型，采用流式细胞仪定量检测β2-GPIDV 对LOX-1与DiI-oxLDL结合的抑制作用，结果显示β2-GPIDV浓度依赖性的干预oxLDL与 DiI-oxLDL的结合。