[发明专利]一种重组蛋白功能结构域抑制巨噬细胞组织因子表达及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及到一种β2-糖蛋白第五结构域(β2-GPIDV)通过抑制和干预oxLDL与LOX-1的结合进而抑制TF和LOX-1的表达，显示了其在抑制动脉粥样硬化血栓形成疾病方面发挥可能的潜在治疗作用。

背景技术

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是以内膜粥样斑块或纤维斑块形成为病变特征的动脉疾病，主要累及大、中动脉，其临床表现主要有心绞痛、心律失常、心肌梗塞，甚至猝死。氧化低密度脂蛋白(oxLDL)是AS的独立危险因子，通过多种途径诱发疾病的发生。其中，巨噬细胞表面清道夫受体识别并内吞oxLDL进而导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞，是动脉粥样硬化疾病发生的关键事件。

研究表明，血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lectin-likeoxidizedlow-densitylipoproteinreceptor-1，LOX-1)是病理条件下内吞oxLDL的一种主要的巨噬细胞表面清道夫受体。LOX-1除吞噬oxLDL导致单核巨噬细胞转变为泡沫细胞诱发AS发生外，还可促发信号转导，引发一系列病理变化，包括内皮细胞功能障碍、泡沫细胞形成及凋亡、炎性介质及基质金属蛋白酶分泌等，参与了AS的发生发展。

组织因子(TissueFactor，TF)是凝血过程的启动子，是决定斑块形成血栓的重要因素之一。研究显示，动脉粥样硬化斑块内含有主要由巨噬细胞贡献表达的组织因子以及巨噬细胞凋亡产生的具有促栓活性的“微粒TF”。当斑块破裂后，这些组织因子以及“微粒TF”便暴露于血浆中，通过其胞外区与活化的凝血因子Ⅶ(FⅦa)结合，启动外源性凝血过程，产生凝血酶和纤维蛋白，活化血小板，最终形成血栓及产生相关并发症。此外，TF还通过增加斑块内炎症反应、促进平滑肌细胞的增生和迁移，导致血管重构形成等方面削弱了动脉斑块的稳定性，从而加快了斑块破裂和血栓形成的进程。

通常情况下，巨噬细胞表达低水平TF，但当受到某些因素刺激，可上调表达TF。研究显示，oxLDL是诱导巨噬细胞TF上调表达的关键致病因素之一。然而LOX-1作为巨噬细胞表面主要清道夫受体，在结合oxLDL介导内吞同时是否介导oxLDL诱导的TF上调表达还未见有报道。

前期的工作基础显示，利用酵母表达的β2-GPIDV通过oxLDL阴性磷脂表位结构与oxLDL相结合，这种结合是否干预了oxLDL与受体LOX-1的结合，进而抑制了oxLDL诱导的TF上调表达，还没有明确。

发明内容

本发明的目的为，明确oxLDL能够上调TF表达，并且这种上调作用是在LOX-1介导下启动的信号调控的，进一步发现重组β2-GPIDV能够抑制oxLDL诱导的TF和LOX-1的表达，进一步利用自主构建的表达人LOX-1基因293T细胞模型采用流式细胞仪方法证明这种抑制作用的分子机理在于干预了oxLDL与LOX-1的结合，进而阻断了下游TF和LOX-1的表达。

(一)oxLDL经由LOX-1诱导小鼠巨噬细胞J774A.1上调TF表达。

(1)qRT-PCR检测小鼠巨噬细胞基因水平表达LOX-1和TF量。

通过设计β-actin、TF、LOX-1三对引物，以β-actin为内参分析TF、LOX-1基因水平表达情况。实验数据显示10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞4小时，LOX-1和TF的mRNA表达显著上调(差异显著，P<0.05)

引物由大连宝生物公司合成，

β-actin上下游引物如下：上游引物：5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3′，

下游引物：5′-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3′；

TF上下游引物如下：上游引物：5′-CCCAAACCCGTCAATCAAGTC-3′，

下游引物：5′-CCAAGTACGTCTGCTTCACAT-3′；

LOX-1上下游引物如下：上游引物：5′-GGTGCTGGGCATGCAATTAT-3′，

下游引物：5′-CATTTCCTTGAGTTCGTTTTCTGA-3′。

(2)Western-Blot检测小鼠巨噬细胞蛋白水平表达LOX-1和TF量。

10μg/mLoxLDL作用于J774A.1细胞24小时，LOX-1和TF的蛋白表达显著上调(差异显著，P<0.05)。