[发明专利]一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病原菌检测技术领域，具体涉及一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法。

背景技术

氟喹诺酮类药物对G-杆菌，包括绿脓杆菌均有良好抗菌作用，对G+球菌也具一定抗菌活性。在氟喹诺酮类较广泛使用的品种中，对绿脓杆菌作用较强的为环丙氟哌酸，其次为氟嗪酸。氟嗪酸对一般阴性杆菌的作用与环丙氟哌酸相仿或稍弱，90年代后开发的新品种多氟哌酸类某些品种，不仅抗G-杆菌活性与环丙氟哌酸相似，而且抗G+球菌作用加强，对MRSA有效，对衣原体、支原体、厌氧菌亦有一定作用，明显优于环丙沙星。

国内外的大量研究表明，由于氟喹诺酮药物长期和大量使用，副溶血弧菌对氟喹诺酮类药物的耐药性十分严重。常见的氟喹诺酮耐药基因已经发现的有：GyrA,GyrB,ParC,ParE等。耐药性产生的直接后果是严重影响了临床疗效，尤其在人畜同药的情况下，耐药性通过水产产品等途径引起的交叉传播，直接对人体健康构成威胁。

目前我国水产产品耐药性检测控制中，传统方法是通过测定副溶血弧菌的最低抑菌浓度或抑菌圈大小测定副溶血弧菌的耐药性。传统的药敏试验必须经过繁琐的副溶血弧菌分离纯化、繁殖扩增等步骤，检测周期长，最快也要48h左右。不利于临床上及时的选药治疗。同时，药敏试验是在体外用药物试探性的检验副溶血弧菌的表型耐药特性，不能检测副溶血弧菌的隐型耐药性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法。

本发明的具体技术方案如下：

一种副溶血弧菌氟喹诺酮类药物耐药基因检测方法，包括如下步骤：

（1）收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，离心后收集上清液，得到模板；

（2）将该模板与氟喹诺酮类药物耐药基因检测引物GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R共同混合后，进行PCR扩增，该PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.3~0.5mmol/L的dNTP、终浓度为0.3~0.5mmol/L的GyrA-F、终浓度为0.3~0.5mmol/L的GyrA-R、终浓度为0.5~0.8mmol/L的GyrB-F、终浓度为0.5~0.8mmol/L的GyrB-R、终浓度为0.5~0.6mmol/L的ParE-F、终浓度为0.5~0.6mmol/L的ParE-R和终浓度为0.02~0.03U/uL的TaqDNA聚合酶，其中GyrA-F、GyrA-R、GyrB-F、GyrB-R、ParE-F和ParE-R分别如SEQID1、SEQID2、SEQID3、SEQID4、SEQID5和SEQID6，上述PCR缓冲液的10倍母液中包括10~20mM氯化钾、pH8.3的12mMTris-HCl和0.01~0.02%氯化钠，20~30mMMgCl₂；

（3）步骤（2）的PCR扩增结束后，进行琼脂糖凝胶电泳并送交测序。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1）为：收集副溶血弧菌活菌体1.0~1.2g，用7~8mL去离子水重悬，反复冻融破碎细胞，10000~12000rpm离心10~15min后收集上清液，得到模板。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应体系中包括超纯水、PCR缓冲液、终浓度均为0.4mmol/L的dNTP、终浓度为0.4mmol/L的GyrA-F、终浓度为0.4mmol/L的GyrA-R、终浓度为0.7mmol/L的GyrB-F、终浓度为0.7mmol/L的GyrB-R、终浓度为0.5mmol/L的ParE-F、终浓度为0.5mmol/L的ParE-R和终浓度为0.02U/uL的TaqDNA聚合酶。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR缓冲液的10倍母液中包括15mM氯化钾、pH8.3的12mMTris-HCl和0.01%氯化钠，30mMMgCl₂。

在本发明的一个优选实施方案中，所述PCR扩增的反应条件如下：90~93℃预变性8~10min，然后进入如下循环：90~93℃变性40s~50s、50~53℃退火40~50s、72~74℃延伸50s~1min，共30~35个循环，循环结束后于72℃延伸5~10min，2~4℃保存。