[发明专利]一种研究微生物间相互关系的透析袋分离培养法

说明书

技术领域

本发明涉及一种研究不同种类微生物共同培养的方法，可更简单、方便地研究不 同微生物之间的相互作用，对研究不同生境下尤其是益生菌产品中各类微生物相互作用意 义重大。

背景技术

近年来，人体肠道益生菌的研究越来越热，益生菌产品的开发更加迅速。益生菌是 一类安全、无毒副作用的健康细菌，能抵抗外来病原菌的侵入，所以对益生菌和其他致病菌 之间相互关系的研究也更加重要，对益生菌产品的开发也具有重要意义。

通常研究细菌间相互作用的方法有细菌共培养法和牛津杯法等。细菌共培养是指 在无菌条件下，一些特别指定的不同的微生物在厌氧或好氧条件下的混合培养。但在研究 细菌之间相互关系时，细菌混合共培养法能使不同种细菌充分接触却无法准确判断培养液 中不同细菌的数目，结果统计困难，不便分析实验结果。牛津杯法是通过获取一种细菌活动 产生的物质，通过牛津杯扩散后研究其对另一种细菌的抑制作用，但是，细菌没有直接接 触，仅仅依赖于细菌活动产生的相关物质，导致了实验结果敏感性下降。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足提供一种研究微生物间相互关系的透析袋 分离培养法。

为实现不同菌群间交流的不同规格透析袋的筛选，选择5kd、10kd、25kd、1000 kd不同孔径的透析袋,通过对酸、葡萄糖、牛血清蛋白的透过时间的检测筛选出可以实现微 生物交流的孔径适宜的透析袋和细菌的最佳培养时间,并通过多种细菌共培养，验证抑菌 效果，从而对该方法进行评价。

本发明所述培养方法包括下列步骤：

（1）pH值检测

a量取去离子无菌水约50ml，加入浓盐酸，用pH调节计配制pH=4的溶液；

b取200ml去离子无菌水放入烧杯A1，同时加入5ml上述pH=4的溶液，用PH计检测烧 杯A1内pH；依次取5ml上述pH=4的溶液分别加入到5kd、10kd、25kd、1000kd透析袋内并用透 析袋夹将其两头密封，将透析袋分别置于200ml去离子无菌水的烧杯B1、C1、D1、E1内，用pH 计检测上述四只烧杯内pH值，记录B1、C1、D1、E1烧杯内PH值达到A1烧杯pH的时间，记为时间 T₁。

（2）葡萄糖检测

a用去离子无菌水配制浓度为25%的葡萄糖溶液50ml

b取200ml去离子无菌水加入烧杯A2，同时加入5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液，用葡 萄糖试剂盒检测并记录烧杯内葡萄糖浓度；依次取5ml上述浓度为25%的葡萄糖溶液分别加 入5kd、10kd、25kd、1000kd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml去离子无菌水的烧杯B2、 C2、D2、E2内，用葡萄糖试剂盒检测烧杯B2、C2、D2、E2内葡萄糖浓度，记录B2、C2、D2、E2烧杯 内葡萄糖浓度达到A2烧杯葡萄糖浓度一致的时间，记为时间T₂。

（3）BSA牛血清蛋白检测

a用无菌PBS配制浓度为2%的牛血清蛋白溶液50ml

b取200mlPBS加入烧杯A3，同时加入5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液，检测并记 录烧杯A3内牛血清蛋白溶液浓度；取5ml上述浓度为2%的牛血清蛋白溶液分别加入5kd、 10kd、25kd、1000kd透析袋内，将透析袋分别放入盛有200ml无菌PBS的烧杯B3、C3、D3、E3内， 检测烧杯B3、C3、D3、E3内牛血清蛋白浓度，记录B3、C3、D3、E3烧杯内牛血清蛋白浓度达到A3 烧杯牛血清蛋白浓度一致的时间，记为时间T₃。

（4）通过对时间T₁、T₂、T₃的统计，确定细菌共培养最佳培养时间为T₄，最佳透析袋 孔径为1000kd。

(5)根据步骤（4）结果，将不同种类微生物转移至1000kd透析袋中，置于相同培养 基中培养24小时后，无菌取出各透析袋中含有细菌的培养基，活菌计数确定各透析袋中微 生物数量，进而确定不同微生物之间的相互促进或拮抗作用。