[发明专利]一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

提取液，1瓶，4℃保存，由蔗糖、EDTA、牛血清白蛋白和苯甲基磺酰氟溶于Tris-HCl缓冲 溶液后配制而成，置于60mL试剂瓶中；

试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由Tris溶于水与冰乙酸的混合液后配制而成，置于30mL 试剂瓶中；

试剂二，粉剂×5支，-20℃保存，均由NADP组成，置于1mL离心管中；

试剂三，粉剂×1瓶,4℃保存，由抗坏血酸组成，置于25mL试剂瓶中；

试剂四，粉剂×1瓶,4℃保存，由钼酸铵组成，置于25mL试剂瓶中；

试剂五，液体×1瓶，室温保存，由浓硫酸与水混合而成，置于25mL试剂瓶中；

试剂六，10mmol/L标准磷贮备液×1瓶，4℃保存，由Na₂HPO₄·12H₂O溶于水后配制而成， 置于10mL试剂瓶中。

2.根据权利要求1所述的NADP磷酸酶活性测定试剂盒，其特征在于：

所述提取液中，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L，pH=7.4，体积为60mL,蔗糖的质 量为5.1g，EDTA的质量为52.6mg，牛血清白蛋白的质量为0.3g，苯甲基磺酰氟的质量为1mg；

所述试剂一中，Tris的质量为0.182g，Tris溶于水后与冰乙酸的混合液的pH=5.5，体积 为30mL；

所述试剂二中，每支离心管内的NADP的质量均为5.5mg；

所述试剂三中，抗坏血酸的质量为2.5g；

所述试剂四中，钼酸铵的质量为0.625g；

所述试剂五中，浓硫酸的体积为3.47mL，水的体积为21.53mL；

所述试剂六中，Na₂HPO₄·12H₂O的质量为35.814mg，水的体积为10mL。

3.一种采用如权利要求2所述的试剂盒的NADP磷酸酶活性测定方法，其特征在于，基于 分光光度法，包括以下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

准备可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、 冰和蒸馏水；

步骤2样本的前处理；

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆，再采用离心率 8000g，在4℃下，离心10min，取上清，置冰上待测；

步骤3试剂临用前的准备；

1）在每支所述试剂二中加入1mL所述试剂一，充分溶解备用，现配现用；

2）在所述试剂三中加入25mL蒸馏水，溶解后备用；

3）在所述试剂四中加入25mL蒸馏水，溶解后备用；

步骤40.5μmol/mL标准磷应用液配制：

将所述试剂六进行20倍稀释，即取0.5mL所述试剂六加入9.5mL蒸馏水，充分混匀；

步骤5定磷试剂的配制；

按水：试剂三：试剂四：试剂五=2:1:1:1的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色，若无 色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配；

步骤6酶促反应；

在测定管和对照管中均加入300μL的所述试剂一和100μL的所述试剂二，并均在37℃或 25℃下预热5min；

在所述测定管中再加入100μL步骤2中前处理过的样本，在所述对照管中再加入100μL 蒸馏水；

将所述测定管和对照管均在37℃或25℃下准确反应30min，接着沸水浴5min，冷却后， 再采用离心率10000g，常温下离心5min，最后取上清液；

步骤7定磷；

1）在标准管中加入100μL的0.5μmol/mL标准磷应用液和1000μL的定磷试剂，在空白管 中加入100μL的蒸馏水和1000μL的定磷试剂，在测定管中加入100μL步骤6中提取的上清液 和1000μL的定磷试剂，在对照管中加入100μL步骤6中提取的上清液和1000μL的定磷试剂；

2）将各管内的物质混匀，在37℃或25℃下分别水浴30min；

3）然后将各管冷却至室温，接着将分光光度计的波长调节在660nm处，蒸馏水调零，记 录各管吸光值；

步骤8根据步骤7中得出的各管吸光值，计算NADP磷酸酶活性；

1）按组织蛋白浓度计算：

NADP磷酸酶(U/mgprot)=(C_标准管×V_总)×(A_测定管-A_对照管)÷(A_标准管-A_空白管)÷(V_样×Cpr)÷T= 5×(A_测定管-A_对照管)÷(A_标准管-A_空白管)÷Cpr；

2）按样本鲜重计算：

NADP磷酸酶(U/g鲜重)=(C_标准管×V_总)×(A_测定管-A_对照管)÷(A_标准管-A_空白管）×V_总÷(W×V_样÷ V_样总)÷T=5×(A_测定管-A_对照管)÷(A_标准管-A_空白管)÷W；

其中，A表示步骤7中各管的吸光值；

C_标准管=0.5μmol/mL，表示标准管的浓度；

V_总=0.5mL，表示酶促反应的总体积；

V_样=0.1mL，表示加入样本的体积；

V_样总=1mL，表示加入提取液的体积；

T=0.5h，表示反应时间；

Cpr表示样本蛋白质的浓度，单位为mg/mL；

W表示样本的鲜重，单位为g。