[发明专利]一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域领域，涉及一种试剂盒，具体涉及一种NADP磷酸酶活性 测定试剂盒及其方法。

背景技术

NADP磷酸酶主要存在于植物组织中，是生物体内唯一催化NADP⁺降解为NAD⁺的酶， 与NADK一起调控NAD和NADP之间的平衡。

目前已有两种NADP磷酸酶活性的测定方法，一种是通过乙醇脱氢酶循环测定NAD 变化，另一种是通过孔雀绿定磷法测定NAD变化。通过乙醇脱氢酶循环测定NAD变化的方法 需要严格控制反应的温度和时间，反应条件不易控制，试剂成本较高。孔雀绿定磷法适用于 测定磷浓度在0.06-2μg范围内的样品，若样品中NADP磷酸酶催化产生的磷含量过高则需要 稀释后测定。而且测定过程需要做预实验，以确定样本中NADP磷酸酶活性产生的无机磷是 否超过了测定范围，较为繁琐。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒及其 方法，可快速准确的计算出NADP磷酸酶活性。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种NADP磷酸酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：

提取液，1瓶，4℃保存，由蔗糖、EDTA、牛血清白蛋白和苯甲基磺酰氟溶于Tris-HCl缓冲 溶液后配制而成，置于60mL试剂瓶中；

试剂一，液体×1瓶，4℃保存，由Tris溶于水与冰乙酸的混合液后配制而成，置于30mL 试剂瓶中；

试剂二，粉剂×5支，-20℃保存，均由NADP组成，置于1mL离心管中；

试剂三，粉剂×1瓶,4℃保存，由抗坏血酸组成，置于25mL试剂瓶中；

试剂四，粉剂×1瓶,4℃保存，由钼酸铵组成，置于25mL试剂瓶中；

试剂五，液体×1瓶，室温保存，由浓硫酸与水混合而成，置于25mL试剂瓶中；

试剂六，10mmol/L标准磷贮备液×1瓶，4℃保存，由Na₂HPO₄·12H₂O溶于水后配制而成， 置于10mL试剂瓶中。

进一步的，所述提取液中，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为50mmol/L，pH=7.4，体积为 60mL,蔗糖的质量为5.1g，EDTA的质量为52.6mg，牛血清白蛋白的质量为0.3g，苯甲基磺酰 氟的质量为1mg；

进一步的，所述试剂一中，Tris的质量为0.182g，Tris溶于水后与冰乙酸的混合液的pH =5.5，体积为30mL；

进一步的，所述试剂二中，每支离心管内的NADP的质量均为5.5mg；

进一步的，所述试剂三中，抗坏血酸的质量为2.5g；

进一步的，所述试剂四中，钼酸铵的质量为0.625g；

进一步的，所述试剂五中，浓硫酸的体积为3.47mL，水的体积为21.53mL；

进一步的，所述试剂六中，Na₂HPO₄·12H₂O的质量为35.814mg，水的体积为10mL。

NADP磷酸酶催化NADP水解生成NAD和无机磷，可通过测定NAD或无机磷的变化来间 接反映NADP磷酸酶活性的高低。

一种基于分光光度法的NADP磷酸酶活性测定方法，包括以下步骤：

步骤1仪器和用品的准备；

准备可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、 冰和蒸馏水；

步骤2样本的前处理；

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：（5~10）的比例，进行冰浴匀浆，再采用离心率 8000g，在4℃下，离心10min，取上清，置冰上待测；

步骤3试剂临用前的准备；

1）在每支所述试剂二中加入1mL所述试剂一，充分溶解备用，现配现用；

2）在所述试剂三中加入25mL蒸馏水，溶解后备用；

3）在所述试剂四中加入25mL蒸馏水，溶解后备用；

步骤40.5μmol/mL标准磷应用液配制：

将所述试剂六进行20倍稀释，即取0.5mL所述试剂六加入9.5mL蒸馏水，充分混匀；

步骤5定磷试剂的配制；