[发明专利]赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法

权利要求书

1.赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法，包括以下步骤：

1）赤魟软骨胶原蛋白的制备：将赤魟软骨晒干、粉碎，按照料液比1g:15～20mL加入到NaOH溶液于1～4℃下浸泡2～4h，脱除非胶原蛋白；处理后赤魟软骨用蒸馏水反复洗涤至中性、沥干，按照料液比1g:5～8mL加入pH7.4的EDTA溶液，于1～4℃下浸泡2～3天，蒸馏水洗涤2～3次，干燥、粉碎，得脱钙赤魟软骨粉；将脱钙赤魟软骨粉按照料液比1g:5～8mL加入到0.5mol/L乙酸溶液并在1～4℃下动态浸泡3d，10000g离心20～25min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0mol/L，静置60～90min，12000g离心25～30min得沉淀物，冷冻干燥即为赤魟软骨胶原蛋白；

2）赤魟软骨胶原蛋白的酶解：将赤魟软骨胶原蛋白按照料液比1g:15～20mL加入到磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，按照胶原蛋白质量的1.0～1.5%向溶液中加入胰蛋白酶，于温度45～50℃酶解3～4h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持8～10min后，冷却至45～50℃；按照胶原蛋白质量的1.5～1.8%向溶液中加入中性蛋白酶，于温度45～50℃下酶解6～8h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持15～20min后，10000g离心20～25min，取上清液，即为酶解产物；

3）赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备：将上述酶解产物采用3.5kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3.5kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化，得抗氧化胶原肽，所制备的抗氧化胶原肽Gly-Ile-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp为八肽化合物，ESI-MS测定分子量为875.85Da；

其中，所述步骤1）中赤魟为赤魟即Dasyatis akajei，NaOH溶液为0.1mol/L；EDTA溶液为0.5mol/L，且每天更换1次；

步骤2）中的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为0.2mol/L、pH值为7.5；胰蛋白酶为1.9×10⁴U/g；中性蛋白酶为1.0×10⁵U/g；

所述步骤3）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱纯化的具体过程为：

离子交换树脂层析：将上述超滤酶解物溶于双蒸水配成浓度为25～30mg/mL的溶液，经过DEAE-52离子交换树脂层析柱，用水、0.5mol/L和1.0mol/LNaCl溶液进行洗脱，流速为0.9～1.2mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于225nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的羟自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为离子交换层析酶解物；

凝胶柱层析：将上述离子交换层析酶解物溶于双蒸水配成浓度为25～30mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶SephadexG-25柱层析分离，用双蒸水进行洗脱，流速为0.8～1.0mL/min，洗出溶液每3min收集一管并于225nm检测，按峰合并试管内溶液，比较各峰的羟自由基的清除活性，选择活性最强组分冻干，即为凝胶层析酶解物；

反相高效液相色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成40～50μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，反相高效液相色谱的条件为：进样量15～20μL；色谱柱是规格为250mm×4.6mm，5μm的ZorbaxSB-C₁₈；流动相为40%乙腈；洗脱速度0.8~1.0mL/min；紫外检测波长225nm，根据对羟自由基的清除活性得1个高活性抗氧化胶原肽Gly-Ile-Glu-Gly-Glu-Glu-Gly-Trp，ESI-MS测定分子量为875.85Da。