[发明专利]赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法

说明书

本发明公开了一种赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法。本发明以赤魟软骨为原料，通过胶原蛋白提取、胰蛋白酶和中性蛋白酶双酶酶解得酶解液，酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化胶原肽Gly‑Ile‑Glu‑Gly‑Glu‑Glu‑Gly‑Trp，ESI‑MS测定分子量为875.85 Da；制备的高活性抗氧化胶原肽对DPPH自由基、羟自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用；同时亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用，可以作为药品、保健食品或食品添加剂进行开发。

技术领域

本发明涉及一种动物软骨胶原肽的制备方法，具体涉及一种赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法。

背景技术

胶原肽是胶原蛋白被蛋白酶降解后的产物，分子量大约在180-3000 Da，被认为比较普通胶原蛋白更利人体消化吸收。同时，现有研究证明胶原肽具有多种生物活性，例如抑制血管紧张素转化酶活性、抗氧化活性，减少膝关节或髋关节等骨关节炎患者的疼痛，增强骨密度，维持骨代谢平衡等。

赤魟（Dasyatis akajei），属软骨鱼纲，下孔总目，鲼形目，魟科，魟属。赤魟为常见软骨鱼类，分布于我国沿海。研究表明赤魟软骨含有大量胶原蛋白，可以作为胶原肽的原料进行开发利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备方法，其包括以下步骤：

1）赤魟软骨胶原蛋白的制备：将赤魟软骨晒干、粉碎，按照料液比1 g:15～20 mL加入到NaOH溶液（0.1 mol/L）于1～4℃下浸泡2～4 h，脱除非胶原蛋白；处理后赤魟软骨用蒸馏水反复洗涤至中性、沥干，按照料液比1 g: 5～8 mL加入pH 7.4的EDTA溶液（0.5 mol/L），于1～4℃下浸泡2～3天（每天更换1次EDTA溶液），蒸馏水洗涤2～3次，干燥、粉碎，得脱钙赤魟软骨粉。将脱钙赤魟软骨粉按照料液比1 g:5～8 mL加入到0.5 mol/L乙酸溶液并在1～4℃下动态浸泡3 d，10 000g离心20～25 min，取上清液，并加入NaCl至溶液终浓度为1.0 mol/L，静置60～90 min，12 000g离心25～30 min得沉淀物，冷冻干燥即为赤魟软骨胶原蛋白。

2）赤魟软骨胶原蛋白的酶解：将赤魟软骨胶原蛋白按照料液比1 g:15～20 mL加入到磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（pH 7.5，0.2 mol/L），按照胶原蛋白质量的1.0～1.5%向溶液中加入胰蛋白酶（1.9×10⁴ U/g），于温度45～50℃酶解3～4 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持8～10 min后，冷却至45～50℃；按照胶原蛋白质量的1.5～1.8%向溶液中加入中性蛋白酶（1.0×10⁵ U/g），于温度45～50℃下酶解6～8 h，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持15～20 min后，10 000g离心20～25 min，取上清液，即为酶解产物；

3）赤魟软骨抗氧化胶原肽的制备：将上述酶解产物采用3.5 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3.5 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得抗氧化胶原肽。

作为优选，所述的步骤1）中的赤魟为赤魟（Dasyatis akajei）。

作为优选，所述步骤4）的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为：