[发明专利]双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽及其用途有效

专利信息
申请号: 201511014862.0 申请日: 2015-12-31
公开(公告)号: CN105646657B 公开(公告)日: 2020-06-16
发明(设计)人: 王斌;李雪荣;赵玉勤;孙坤来 申请(专利权)人: 浙江海洋学院
主分类号: C07K7/06 分类号: C07K7/06;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16
代理公司: 杭州浙科专利事务所(普通合伙) 33213 代理人: 吴秉中
地址: 316022 浙江省*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 双髻鲨 软骨 蛋白 氧化 及其 用途
【说明书】:

发明公开了一种双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法。本发明以双髻鲨软骨为原料,通过总蛋白提取、丙酮分级沉淀、胰蛋白酶酶解得酶解液,酶解液采用超滤、离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化肽Gly‑Phe‑Thr‑Gly‑Pro‑Pro‑Gly‑Phe‑Asn‑Gly,ESI‑MS测定分子量为950.03 Da;制备的高活性抗氧化肽具有较强的自由基清除活性和良好的脂质过氧化抑制作用,可以作为药品、保健食品或食品添加剂等进行开发。

技术领域

本发明涉及一种抗氧化活性肽,具体涉及一种双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽及其用途。

背景技术

鲨鱼全身是宝,有的种类肉质鲜美,是餐桌上常见的菜肴。鱼皮具有良好的韧性,是皮革加工业的原料。现代医学证明鲨鱼软骨具有很大的药用价值,1992年美国首先将鲨鱼软骨粉直接用于临床治疗肿瘤。双髻鲨(Sphyrna lewini)为软骨鱼纲,真鲨目,双髻鲨科,在我国主要分布于黄海、东海和南海。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种能够清除自由基和抑制脂质过氧化作用的双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为:一种双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽:抗氧化肽为十肽化合物,氨基酸序列为Gly-Phe-Thr-Gly-Pro-Pro-Gly-Phe-Asn-Gly ,ESI-MS测定分子量为950.03 Da

该双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备方法为:

1)双髻鲨软骨总蛋白粗提物的制备:称取双髻鲨软骨切成小碎块,加入适量蒸馏水,在高速组织捣碎机中匀浆至糊状,将糊状的双髻鲨软骨浸于4~6倍体积的1.0 mol/L盐酸胍溶液中(含0.02 mol/L MES和0.02 mol/L EDTA,pH 7~8),于4 ℃下搅拌抽提36~48h。提取液在4 ℃下以4000~6000 r/min离心15~25 min,弃残渣收集上清液;上清液继续在4 ℃、10000~12000 r/min离心15~25 min,取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除去不溶性杂质。将滤液装入分子截留量为8000的透析袋中,用Tris-HCl(pH 7.6)缓冲液于4℃下透析24~48h,透析袋内溶液即为双髻鲨软骨总蛋白粗提物。

2)双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的制备:取双髻鲨软骨总蛋白粗提物在冰浴下缓慢加入预冷丙酮至丙酮浓度为30%,在-20℃下静置4~6h后,于4℃、10000~12000 r/min高速离心20min,取上清液,加入预冷丙酮至溶液最终丙酮浓度为60%,获得双髻鲨软骨60%丙酮沉淀蛋白,冻干,即为60%丙酮分级沉淀蛋白。

3)双髻鲨软骨丙酮分级沉淀蛋白的酶解:取双髻鲨软骨60%丙酮分级沉淀蛋白按照料液比1g:3~5 mL溶于Tris-HCl缓冲液(0.05mol/L,pH 7.5~8.5),按照60%丙酮分级沉淀蛋白重量的2.0~3.0%加入胰蛋白酶(1.9×104 U/g),于40℃酶解3~5h,然后于90℃、10min灭酶活,酶解液于4℃、10000~12000 r/min离心15~25 min,弃残渣收集上清液,得软骨蛋白酶解液。

4)双髻鲨软骨蛋白抗氧化肽的制备:将上述酶解液采用3 kDa超滤膜进行超滤处理,收集分子量小于3 kDa部分,冻干,得超滤酶解物;将超滤酶解物次经离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化,得抗氧化肽。

作为优选,所述的步骤1)中的双髻鲨为双髻鲨(Sphyrna lewini)。

作为优选,所述步骤4)的离子交换树脂层析、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化的具体过程为:

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