[发明专利]一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及糖化血红蛋白检测技术领域，尤其涉及一种检测糖化血红蛋白的一体化试剂盒及其检测方法。

背景技术

糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢疾病，目前发病率仅次于心血管疾病和肿瘤。目前，糖尿病的发病率呈不断上升趋势，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。传统的糖尿病诊断和治疗监测采用空腹血糖、餐后血糖和口服葡萄糖耐量试验等，但是血糖参数仅代表抽血时的瞬间血糖水平，而糖化血红蛋白(glycosylatedhemoglobin,GHb)作为反映长期血糖水平的金标准，也是监测糖尿病治疗的重要指标

GHb是指结合了任何形式碳水化合物的血红蛋白(hemoglobin，Hb)。人类Hb主要是HbA(95%～97%)、HbA2(<3%)、HbF(<1%)。HbA中未结合糖的为HbA0(90%)、结合糖的为HbA1(5%～7%)即GHb。其中HbA1包括结合果糖-1,6-二磷酸葡萄糖的HbA1a1、结合葡萄糖-6-磷酸的HbA1a2、结合未知碳水化合物的HbA1b和结合葡萄糖的HbA1c，HbA1c占GHb的70%～90%。HbA1c在组织中由葡萄糖的游离醛基与HbA的β链N末端缬氨酸的氨基进行不可逆的非酶促的反应，此过程称为糖基化，GHb的形成主要取决于血糖浓度及血糖与Hb的接触时间。GHb可以反映最近2～3个月的平均血糖水平。2002年美国糖尿病协会已明确规定应定期检测HbA1c，并将其作为监测糖尿病血糖控制的金标准。

GHb的测定方法有几十种之多，目前常用的基本上可分为两大类：一类是基于GHb和Hb的电荷不同，如离子交换层析法、电泳法；另一类是基于Hb上糖化基团的结构特点，如亲和层析法、免疫法和酶法等。多个研究表明不同的原理测定的结果存在差别，而糖尿病患者治疗目标要求测定值不受测定方法的影响，因此在实验室里应用不同GHb测定方法所产生的结果可比性非常重要。

离子交换层析法主要有高效液相色谱法(highperformanceliquidchromatography，HPLC)和手工微柱法。此方法是基于血红蛋白β链N末端缬氨酸糖化后所带电荷不同而建立。但由于此方法所使用的仪器昂贵，难以在比较基层的医院和实验室普及；微柱法手工操作步骤繁琐，层析时间和微柱的质量不易控制，易产生操作技术误差，重复性欠佳；而且干扰因素很多，尤其对pH值和温度的变化敏感，HbF及变异血红蛋白(HbS、HbC、HbE等)对结果干扰，干扰程度根据柱的分离能力而定，所以一定要仔细观察图谱。

电泳法（以琼脂凝胶电泳为例）Hb于酸性缓冲液条件下(pH6.0)在琼脂糖凝胶上的电泳迁移取决于Hb在凝胶上的吸附情况及其所带的电荷。该方法标本用量少，分辨率高，重复性好，有研究发现血糖值与HbAlc值有显著相关性，且结果不受温度及胎儿血红蛋白的影响。另外，因为它可测定的Hb线性范围较宽(13.0-39.0g/L)，可发现异常Hb。该方法的缺点是每次测定均需成批进行样本分析，速度比较慢，无法进行实时个体检测，自动化程度较差，所测结果与技术人员扫描和对电泳的波峰判断有关，受主观因素影响，并且费用昂贵，因此并不适合临床实验室常规使用。

亲和层析法硼酸具有与整合在Hb分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质。通常使用的是间-氨基苯硼酸琼脂糖，将血样本加到层析柱后，所有的GHb与硼酸结合留在柱中，非GHb直接流出层析柱；再加入高浓度也包含顺位二醇基的多羟基复合物（如山梨醇），GHb与硼酸的结合被替换而被洗脱下来，分别测量两组分，并计算比值。亲和层析法对变异血红蛋白和病理血红蛋白的影响相对其他方法不敏感，但测定的是HbA₁即GHb总量。另外，金标法和硼酸亲和层析法密切相关，操作均简便易行、快速准确、试剂稳定。据报道，该法不受除HbS和HbC之外的任何血红蛋白变异体和降解产物的干扰，结果可靠，比较适用于临床随时检测。

免疫比浊法利用抗原、抗体反应的原理进行测定。GHb的β链N末端提供了一个容易被抗体识别的抗原表位，可以用单克隆抗体或多克隆抗体，特异识别GHb的β链N末端最后4～6个氨基酸组成的抗原表位，结合比色或比浊法，以GHb为标准，测定HbA1c的含量，再测定Hb的含量，最后计算出HbA1c占总Hb的百分含量。此类方法只能作为判断糖尿病血糖水平的指标，不可用于变异血红蛋白的研究。与其相比，免疫比浊法检测的方法更为简单，不需要额外添加仪器，为临床提供了一种快速、准确、可靠、简便的常规方法，在临床应用中有着更为广阔的前景。