[发明专利]一种测定rhCNB含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种测定rhCNB含量的方法。

背景技术

蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系，最常见的是半胱氨酸，蛋白质对空气中的氧较为敏感，容易发生结构的转变，形成一系列聚合物。

钙调磷酸酶(Calcineurin,CN)是目前所知唯一一种依赖Ca²⁺/CaM(钙调素)的蛋白磷酸酶，由A，B亚基以1：1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，B亚基(CNB)是调节亚基。CN在免疫激活通路中发挥重要作用，示T细胞活化的关键没。CN作为大分子酶蛋白，易失活，不稳定，而CNB作为该酶的调节亚基，能促进CAN的活性，且相对分子质量小，性质稳定。由研究表明CNB能刺激T细胞和NK细胞增殖以及增强NK细胞的杀伤活性，增强巨噬细胞吞噬能力等免疫功能，且重组人钙调磷酸酶B亚基(Recombinant human Calcineurin B subunit,rhCNB)是开发中的基因工程创新肿瘤药物。

rhCNB具有明显的杀伤肿瘤细胞的作用，单体是一种含有两个巯基结构的蛋白，在生产、放置等过程中，易受温度、水分、pH值、光照、氧化等因素影响形成二聚体、三聚体等多聚体结构，造成各组分比例不稳定，无法准确测定其量。其纯化工艺中又需要用到缓冲盐、络合剂、金属离子、氧化还原性物质等等对蛋白测定有干扰的物质。

传统的蛋白质测量方法普遍存在专属性弱、准确度低、重复性差、操作复杂、易受干扰等等缺点。蛋白质在纯化过程中往往含有各种干扰性物质或者目标蛋白自身组分复杂等问题，造成目标蛋白在各工艺步骤中回收率难以准确计算。

凯氏定氮法缺点：①主要针对氮为负三价的有机氮化合物，不包括叠氮化合物,联氮,偶氮,腙,硝酸盐,亚硝酸盐,硝基,腈,肟和半卡巴腙类的含氮化合物，导致最终测定的是总有机氮，而不只是蛋白质氮；②精度差；③所用试剂有腐蚀性等问题。

Lowry法缺点：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质,有一定的误差.故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。②若样品中含有嘌呤、嘧啶、核酸等吸收紫外光的物质,会出现较大干扰。

Folin酚法缺点：①费时，要精确控制操作时间；②试剂的配制比较繁琐且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原型DTT、巯基乙醇、EDTA、脲素均会干扰反应。

紫外吸收法缺点①测定蛋白质含量的准确度较差，专一性差；②干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。

考马斯亮蓝法缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

双缩脲法缺点①灵敏度差；②Tris、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

2010版《中国药典》三部附录ⅥU采用高效液相法及C₁₈色谱柱梯度洗脱检测重组人粒细胞集落刺激因子方法，对疏水性相近的蛋白质分辨率较低。

因此，提供一种准确测定重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基蛋白质含量的方法具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种测定rhCNB含量的方法。该方法能够准确测定rhCNB的含量，排除使用经典方法所带来的重复性差、抗干扰能力低、结果不准确等问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种测定rhCNB含量的方法，包括如下步骤：

步骤1：取rhCNB粗品，与还原剂混合发生还原反应，制得供试品溶液；

步骤2：取所述供试品溶液、已经标定的RhCNB对照品分别经高效液相色谱测定，按照外标法以峰面积获得rhCNB的含量。

在本发明的一些具体实施方案中，所述还原剂为还原型DTT(二硫苏糖醇)、还原型谷胱苷肽、β-巯基乙醇、硼氢化钠或亚硫酸氢钠中的一种或两者以上的混合物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述还原反应的反应温度为80℃～100℃，所述还原反应的反应时间为15～60min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述还原剂的使用量至少为所述rhCNB粗品的蛋白量的1％(w/w)。

在本发明的一些具体实施方案中，以g/mol计，所述rhCNB粗品(折纯重组人钙调蛋白磷酸酶B亚基6.0mg)与所述还原剂的质量摩尔比为6:0.08。